[求助] 套叠PCR

2楼: Originally posted by imyting at 2012-03-27 13:12:15:
你说的应该是重叠延伸PCR吧，第二步PCR的确比较难P，原因也多种多样，我看你还是在退火温度上琢磨一下吧，试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析，原因太多。重叠部分过短，重叠部分有非特异性结 ...

4楼: Originally posted by 敏敏8305 at 2012-03-27 18:10:25:
请问楼主是做关于噬菌体展示技术方面的吗？

6楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-28 13:32:28:
很可能是引物设计的问题....不知道你要删去的片段有多大（几个氨基酸还是大片段），还有你删去片段的具体方法...所以原因不太好说。

8楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-28 19:34:52:

考虑模板浓度，重叠长短是否合适后
扩增之前不加全长引物，让其反应15-20个循环充分搭桥后，再加引物进行全长扩增，不知道你试过没
good luck！

7楼: Originally posted by lincy2010 at 2012-03-28 15:09:17:
这里的浓度比1:1是质量浓度还是摩尔浓度？应该要用摩尔浓度，因为发现你的两个片段大小相差较大。不过我之前做重叠延伸也没测浓度，看跑胶亮度差不多，切胶回收后按体积比1:1加的。不过估计问题应该不是出在这里， ...

13楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-29 09:27:22:
先对照marker 计算出质量浓度后 换成摩尔浓度 1:1  
不加引物先循环是让两个片段互为引物扩增 使重叠区更好的搭桥 得到特异性扩增 之后扩增更好将全长扩出 我试过 但引物问题 没有扩出来 此做法有相关文献报道  ...

7楼: Originally posted by lincy2010 at 2012-03-28 15:09:17:
这里的浓度比1:1是质量浓度还是摩尔浓度？应该要用摩尔浓度，因为发现你的两个片段大小相差较大。不过我之前做重叠延伸也没测浓度，看跑胶亮度差不多，切胶回收后按体积比1:1加的。不过估计问题应该不是出在这里， ...