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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 套叠PCR
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本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看

小猫三两只

金虫 (正式写手)

[求助] 套叠PCR

我想把基因内部的一段序列突变掉，采用套叠PCR的方法，两段PCR回收的大小分别为1400bp和200bp左右，但将这两段回收产物混合后作模板进行套叠，却怎么也扩不出目的带，请问是什么原因啊？我是大概按照浓度比1：1混合的，并且也试过不同体积的混合，结果都是一样，片段在250bp稍往上一点
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2012-03-27 12:38:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖提供有帮助的信息！ 2012-03-27 19:17:27
你说的应该是重叠延伸PCR吧，第二步PCR的确比较难P，原因也多种多样，我看你还是在退火温度上琢磨一下吧，试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析，原因太多。重叠部分过短，重叠部分有非特异性结合等等，爱莫能助！
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
2楼2012-03-27 13:12:15
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普通回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2012-03-27 13:12:15:
你说的应该是重叠延伸PCR吧，第二步PCR的确比较难P，原因也多种多样，我看你还是在退火温度上琢磨一下吧，试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析，原因太多。重叠部分过短，重叠部分有非特异性结 ...

是一个基因内缺失一段，用的基因内引物就把缺失的那段跨过去，扩增出两段后，再用全长基因的上下游引物，PCR混合产物作模板扩增。梯度我也试过，没什么效果
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3楼2012-03-27 15:50:13
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敏敏8305

铜虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 应助指数-1, 希望以后不应助的话，不要点应助哦 2012-03-29 10:26:22
请问楼主是做关于噬菌体展示技术方面的吗？
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My heart will go on!
4楼2012-03-27 18:10:25
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 敏敏8305 at 2012-03-27 18:10:25:
请问楼主是做关于噬菌体展示技术方面的吗？

呵呵，不是的，就是研究基因的功能，缺失掉一段看基因功能有没有变化
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5楼2012-03-27 20:52:10
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很可能是引物设计的问题....不知道你要删去的片段有多大（几个氨基酸还是大片段），还有你删去片段的具体方法...所以原因不太好说。
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6楼2012-03-28 13:32:28
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助哦 2012-03-29 10:26:44
这里的浓度比1:1是质量浓度还是摩尔浓度？应该要用摩尔浓度，因为发现你的两个片段大小相差较大。不过我之前做重叠延伸也没测浓度，看跑胶亮度差不多，切胶回收后按体积比1:1加的。不过估计问题应该不是出在这里，要看你设计的overlap多长，我一般把第二片段的上游引物的反向互补直接加到第一个片段的下游引物5‘端，所以overlap大概40bp左右。做了两次重叠延伸都没问题，现在准备做第三个
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
7楼2012-03-28 15:09:17
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果子么么茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-29 10:26:58
小猫三两只: 金币+2, ★有帮助, 谢谢，我试试 2012-03-30 16:04:31

考虑模板浓度，重叠长短是否合适后
扩增之前不加全长引物，让其反应15-20个循环充分搭桥后，再加引物进行全长扩增，不知道你试过没
good luck！
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8楼2012-03-28 19:34:52
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-28 13:32:28:
很可能是引物设计的问题....不知道你要删去的片段有多大（几个氨基酸还是大片段），还有你删去片段的具体方法...所以原因不太好说。

中间去掉十几个氨基酸，就是用基因的上游引物作上游，在跨过这缺失的片段处的上下分别选择10几个碱基共20多个碱基作下游扩增得到第一个片段 ，同样再以这样的方法，以基因的末端作下游引物扩增得到第二个片段，再以这两个片段混合后作模板，用基因的全长引物扩增
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9楼2012-03-28 22:50:35
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-28 19:34:52:

考虑模板浓度，重叠长短是否合适后
扩增之前不加全长引物，让其反应15-20个循环充分搭桥后，再加引物进行全长扩增，不知道你试过没
good luck！

得到的两个片段一个1400左右，一个200左右，浓度差不多。不加引物先循环是怎么回事，是将它们混合后作模板，不加引物配好体系按正常PCR程序进行15－20个循环，然后再拿出来加引物扩增吗？这样可以吗，你做过没
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10楼2012-03-28 22:53:30
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