24小时热门版块排行榜    

查看: 1842  |  回复: 18
本帖产生 2 个 MolEPI ,点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)

[求助] 套叠PCR

我想把基因内部的一段序列突变掉,采用套叠PCR的方法,两段PCR回收的大小分别为1400bp和200bp左右,但将这两段回收产物混合后作模板进行套叠,却怎么也扩不出目的带,请问是什么原因啊?我是大概按照浓度比1:1混合的,并且也试过不同体积的混合,结果都是一样,片段在250bp稍往上一点
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助哦 2012-03-29 10:26:44
这里的浓度比1:1是质量浓度还是摩尔浓度?应该要用摩尔浓度,因为发现你的两个片段大小相差较大。不过我之前做重叠延伸也没测浓度,看跑胶亮度差不多,切胶回收后按体积比1:1加的。不过估计问题应该不是出在这里,要看你设计的overlap多长,我一般把第二片段的上游引物的反向互补直接加到第一个片段的下游引物5‘端,所以overlap大概40bp左右。做了两次重叠延伸都没问题,现在准备做第三个
耐得住寂寞,方能遇见繁华
7楼2012-03-28 15:09:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 19 个回答

imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖提供有帮助的信息! 2012-03-27 19:17:27
你说的应该是重叠延伸PCR吧,第二步PCR的确比较难P,原因也多种多样,我看你还是在退火温度上琢磨一下吧,试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析,原因太多。重叠部分过短,重叠部分有非特异性结合等等,爱莫能助!
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
2楼2012-03-27 13:12:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2012-03-27 13:12:15:
你说的应该是重叠延伸PCR吧,第二步PCR的确比较难P,原因也多种多样,我看你还是在退火温度上琢磨一下吧,试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析,原因太多。重叠部分过短,重叠部分有非特异性结 ...

是一个基因内缺失一段,用的基因内引物就把缺失的那段跨过去,扩增出两段后,再用全长基因的上下游引物,PCR混合产物作模板扩增。梯度我也试过,没什么效果
3楼2012-03-27 15:50:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

敏敏8305

铜虫 (初入文坛)

感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 应助指数-1, 希望以后不应助的话,不要点应助哦 2012-03-29 10:26:22
请问楼主是做关于噬菌体展示技术方面的吗?
My heart will go on!
4楼2012-03-27 18:10:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +3 启萌科技 2026-08-12 9/450 2026-08-13 19:29 by 启萌科技
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] Filecode 又变了,巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +9 majunge000 2026-08-10 11/550 2026-08-13 10:40 by ZH远山
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +9 家与远方 2026-08-10 14/700 2026-08-13 09:41 by 臭臭不臭01
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +22 Lanmanbaby 2026-08-09 36/1800 2026-08-12 22:50 by sdfapple719
[论文投稿] 职称评审,求友友推荐见刊最快的期刊 +4 工厂打螺丝 2026-08-08 4/200 2026-08-12 09:18 by hansi2025
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分? +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +8 Tide man 2026-08-10 9/450 2026-08-11 20:39 by beefly
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[硕博家园] 读博的好处 +3 lnee 2026-08-11 3/150 2026-08-11 18:10 by 希望我好好的
[基金申请] 什么时候出结果,有咨询渠道??? +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 关于代码变化问题,想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] fileCode有新解读? +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变,有变的大神么? +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
信息提示
请填处理意见