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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good! 2,3点正解！！ 2012-03-29 17:37:49
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！我试着换下引物 2012-03-30 16:00:24
1.不是浓度比，是摩尔比1:1。
2.扩不出来是因为第二轮使用的引物就是第一步扩增这两个片段的上游和下游引物。在第二轮扩增时，引物与模板的结合因为“顶头”结合，所以结合效率降低，导致扩增效果受影响。
3.可以尝试第一轮扩增时使引物外延一段，第二轮扩增使用现在的引物，同时调整退火温度，使引物更好的结合模板，就可以解决此问题了。
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生活是面镜子~
12楼2012-03-29 01:24:04
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 很热心哈！祝试验成功~ 2012-03-29 17:50:45
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 我重新再做一遍看看 2012-03-30 16:01:30
引用回帖:
17楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-29 15:49:17:
“我一般把第二片段的上游引物的反向互补直接加到第一个片段的下游引物5‘端，所以overlap大概40bp左右。”按照你的做法，难道我引物设计的有问题？我的第一个片段的下游引物和第二个片段的上游引物是完全反向互 ...

首先，如12楼所说重叠延伸第一步是顶头结合，结合效率比正常的低，所以应该适当设计得长点。比如我们实验室就有人以片断为模版，打算通过两次加tail pcr最终使得片断前加了一两百bp。在第二次加tail pcr时，改了很多条件怎么p都p不出来，后来还是先把第一次加tail产物连在载体上，以载体做模版才p成功。个人认为之前之所以不成功就是因为顶头结合的原故，以载体为模板就避免了这个问题。当然重叠延伸肯定不能通过这种方式避开，但可以加强overlap的结合强度。至于你实验室前人有做过成功了，但你们的overlap又不一样，结合强度又不单看碱基个数，还有gc含量、分步，以及所形成二级结构也是会影响的。
其次，你分别p那两个片段的时候，最后一步72度设置了多长时间？这一步确保片断末端完整性，所以也可以适当延长点，我一般都设10min，有时不急着用的话设个20min。不过这步应该也影响不大。估计还是重叠延伸第一步时出了问题。
以上个人浅见，仅供参考。晚上也要做第三个重叠延伸，然望一次就通过哈
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
18楼2012-03-29 17:41:58
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