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[求助]
套叠PCR
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| 我想把基因内部的一段序列突变掉，采用套叠PCR的方法，两段PCR回收的大小分别为1400bp和200bp左右，但将这两段回收产物混合后作模板进行套叠，却怎么也扩不出目的带，请问是什么原因啊？我是大概按照浓度比1：1混合的，并且也试过不同体积的混合，结果都是一样，片段在250bp稍往上一点 |
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【答案】应助回帖
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 很热心哈！祝试验成功~ 2012-03-29 17:50:45
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 我重新再做一遍看看 2012-03-30 16:01:30
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 很热心哈！祝试验成功~ 2012-03-29 17:50:45
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 我重新再做一遍看看 2012-03-30 16:01:30
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首先，如12楼所说重叠延伸第一步是顶头结合，结合效率比正常的低，所以应该适当设计得长点。比如我们实验室就有人以片断为模版，打算通过两次加tail pcr最终使得片断前加了一两百bp。在第二次加tail pcr时，改了很多条件怎么p都p不出来，后来还是先把第一次加tail产物连在载体上，以载体做模版才p成功。个人认为之前之所以不成功就是因为顶头结合的原故，以载体为模板就避免了这个问题。当然重叠延伸肯定不能通过这种方式避开，但可以加强overlap的结合强度。至于你实验室前人有做过成功了，但你们的overlap又不一样，结合强度又不单看碱基个数，还有gc含量、分步，以及所形成二级结构也是会影响的。 其次，你分别p那两个片段的时候，最后一步72度设置了多长时间？这一步确保片断末端完整性，所以也可以适当延长点，我一般都设10min，有时不急着用的话设个20min。不过这步应该也影响不大。估计还是重叠延伸第一步时出了问题。 以上个人浅见，仅供参考。晚上也要做第三个重叠延伸，然望一次就通过哈  |
18楼2012-03-29 17:41:58
imyting
至尊木虫 (正式写手)
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2楼2012-03-27 13:12:15
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