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[求助]
套叠PCR
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| 我想把基因内部的一段序列突变掉，采用套叠PCR的方法，两段PCR回收的大小分别为1400bp和200bp左右，但将这两段回收产物混合后作模板进行套叠，却怎么也扩不出目的带，请问是什么原因啊？我是大概按照浓度比1：1混合的，并且也试过不同体积的混合，结果都是一样，片段在250bp稍往上一点 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good! 2,3点正解！！ 2012-03-29 17:37:49
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！我试着换下引物 2012-03-30 16:00:24
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小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！我试着换下引物 2012-03-30 16:00:24
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1.不是浓度比，是摩尔比1:1。 2.扩不出来是因为第二轮使用的引物就是第一步扩增这两个片段的上游和下游引物。在第二轮扩增时，引物与模板的结合因为“顶头”结合，所以结合效率降低，导致扩增效果受影响。 3.可以尝试第一轮扩增时使引物外延一段，第二轮扩增使用现在的引物，同时调整退火温度，使引物更好的结合模板，就可以解决此问题了。 |
12楼2012-03-29 01:24:04
imyting
至尊木虫 (正式写手)
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2楼2012-03-27 13:12:15
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