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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[求助] 套叠PCR

我想把基因内部的一段序列突变掉,采用套叠PCR的方法,两段PCR回收的大小分别为1400bp和200bp左右,但将这两段回收产物混合后作模板进行套叠,却怎么也扩不出目的带,请问是什么原因啊?我是大概按照浓度比1:1混合的,并且也试过不同体积的混合,结果都是一样,片段在250bp稍往上一点
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-28 19:34:52:

考虑模板浓度,重叠长短是否合适后
扩增之前不加全长引物,让其反应15-20个循环充分搭桥后,再加引物进行全长扩增,不知道你试过没
good luck!

得到的两个片段一个1400左右,一个200左右,浓度差不多。不加引物先循环是怎么回事,是将它们混合后作模板,不加引物配好体系按正常PCR程序进行15-20个循环,然后再拿出来加引物扩增吗?这样可以吗,你做过没
10楼2012-03-28 22:53:30
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖提供有帮助的信息! 2012-03-27 19:17:27
你说的应该是重叠延伸PCR吧,第二步PCR的确比较难P,原因也多种多样,我看你还是在退火温度上琢磨一下吧,试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析,原因太多。重叠部分过短,重叠部分有非特异性结合等等,爱莫能助!
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
2楼2012-03-27 13:12:15
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2012-03-27 13:12:15:
你说的应该是重叠延伸PCR吧,第二步PCR的确比较难P,原因也多种多样,我看你还是在退火温度上琢磨一下吧,试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析,原因太多。重叠部分过短,重叠部分有非特异性结 ...

是一个基因内缺失一段,用的基因内引物就把缺失的那段跨过去,扩增出两段后,再用全长基因的上下游引物,PCR混合产物作模板扩增。梯度我也试过,没什么效果
3楼2012-03-27 15:50:13
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敏敏8305

铜虫 (初入文坛)

感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 应助指数-1, 希望以后不应助的话,不要点应助哦 2012-03-29 10:26:22
请问楼主是做关于噬菌体展示技术方面的吗?
My heart will go on!
4楼2012-03-27 18:10:25
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