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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 套叠PCR
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lincy2010 at 2012-03-28 15:09:17:
这里的浓度比1:1是质量浓度还是摩尔浓度？应该要用摩尔浓度，因为发现你的两个片段大小相差较大。不过我之前做重叠延伸也没测浓度，看跑胶亮度差不多，切胶回收后按体积比1:1加的。不过估计问题应该不是出在这里， ...

这两段的重叠区就是扩增第一个片段的下游引物，和扩增第二个片段的上游引物，它们是反向互补序列。因为我要缺失10几个氨基酸，就在这对应的30多个碱基的前面找13个碱基，在它后面找13个碱基，这样的26个碱基的反向互补序列就作为扩增前面一个片段的下游引物，而本身序列就作为扩增第二个片段的上游序列
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11楼2012-03-28 22:58:05
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good! 2,3点正解！！ 2012-03-29 17:37:49
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！我试着换下引物 2012-03-30 16:00:24
1.不是浓度比，是摩尔比1:1。
2.扩不出来是因为第二轮使用的引物就是第一步扩增这两个片段的上游和下游引物。在第二轮扩增时，引物与模板的结合因为“顶头”结合，所以结合效率降低，导致扩增效果受影响。
3.可以尝试第一轮扩增时使引物外延一段，第二轮扩增使用现在的引物，同时调整退火温度，使引物更好的结合模板，就可以解决此问题了。
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生活是面镜子~
12楼2012-03-29 01:24:04
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果子么么茶

木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-03-29 17:38:07
西瓜: 回帖置顶 2012-03-29 17:49:39
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-28 22:53:30:
得到的两个片段一个1400左右，一个200左右，浓度差不多。不加引物先循环是怎么回事，是将它们混合后作模板，不加引物配好体系按正常PCR程序进行15－20个循环，然后再拿出来加引物扩增吗？这样可以吗，你做过没

先对照marker 计算出质量浓度后 换成摩尔浓度 1:1  
不加引物先循环是让两个片段互为引物扩增 使重叠区更好的搭桥 得到特异性扩增 之后扩增更好将全长扩出 我试过 但引物问题 没有扩出来 此做法有相关文献报道 不一定15-20 循环 可以少些
重叠PCR能成功 有效退火很重要 可以尝试 TOUCHDOWN PCR
还有 你的重叠区是13bp？ 好短 能搭桥的上吗？
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13楼2012-03-29 09:27:22
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-03-29 17:39:09
西瓜: 回帖置顶 2012-03-29 17:49:49
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 这个方法我试试，谢谢 2012-03-30 16:03:36
首先，加入的模板量的比例应该是摩尔比为1:1，其次，可以先不加上下游引物而让这两个片段搭到一起的那段为彼此的引物进行10个循环的扩增，然后再加入上下游引物扩增20个循环，如果还没有p出来的话，可以在不加引物的那十个循环里采取两步pcr的方法，我刚做了over lap pcr，2000bp的片段跟1000bp的片段一起搭，就是通过两步pcr做出来的，三步法压根没戏。
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14楼2012-03-29 11:53:40
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-28 22:58:05:
这两段的重叠区就是扩增第一个片段的下游引物，和扩增第二个片段的上游引物，它们是反向互补序列。因为我要缺失10几个氨基酸，就在这对应的30多个碱基的前面找13个碱基，在它后面找13个碱基，这样的26个碱基的反 ...

我觉得你总共26bp的overlap有点短，可以加长点。我通常都是用40bp左右
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
15楼2012-03-29 14:03:55
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-29 09:27:22:
先对照marker 计算出质量浓度后 换成摩尔浓度 1:1  
不加引物先循环是让两个片段互为引物扩增 使重叠区更好的搭桥 得到特异性扩增 之后扩增更好将全长扩出 我试过 但引物问题 没有扩出来 此做法有相关文献报道  ...

touchdown PCR我也试过，没扩出来。另外，我的重叠区应该是26bp吧，第一个片段的下游引物和第二个片段的上游引物是完全互补的，它们就是重叠的，这两个引物实际上是跨过了我要缺失的那一段，最终得到的基因就是我要的突变体
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16楼2012-03-29 15:43:48
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lincy2010 at 2012-03-28 15:09:17:
这里的浓度比1:1是质量浓度还是摩尔浓度？应该要用摩尔浓度，因为发现你的两个片段大小相差较大。不过我之前做重叠延伸也没测浓度，看跑胶亮度差不多，切胶回收后按体积比1:1加的。不过估计问题应该不是出在这里， ...

“我一般把第二片段的上游引物的反向互补直接加到第一个片段的下游引物5‘端，所以overlap大概40bp左右。”按照你的做法，难道我引物设计的有问题？我的第一个片段的下游引物和第二个片段的上游引物是完全反向互补的，这两个引物跨过了我要缺失的片段，即引物序列的26个碱基，有13个是缺失区前面的，13个是缺失区后面的，这样这个重叠区就有26bp了。不过我实验室以前有人做过，就是这种方法做的，而且他缺失了100多个碱基，也是在缺失区的上下游各选13bp作引物
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17楼2012-03-29 15:49:17
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 很热心哈！祝试验成功~ 2012-03-29 17:50:45
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 我重新再做一遍看看 2012-03-30 16:01:30
引用回帖:
17楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-29 15:49:17:
“我一般把第二片段的上游引物的反向互补直接加到第一个片段的下游引物5‘端，所以overlap大概40bp左右。”按照你的做法，难道我引物设计的有问题？我的第一个片段的下游引物和第二个片段的上游引物是完全反向互 ...

首先，如12楼所说重叠延伸第一步是顶头结合，结合效率比正常的低，所以应该适当设计得长点。比如我们实验室就有人以片断为模版，打算通过两次加tail pcr最终使得片断前加了一两百bp。在第二次加tail pcr时，改了很多条件怎么p都p不出来，后来还是先把第一次加tail产物连在载体上，以载体做模版才p成功。个人认为之前之所以不成功就是因为顶头结合的原故，以载体为模板就避免了这个问题。当然重叠延伸肯定不能通过这种方式避开，但可以加强overlap的结合强度。至于你实验室前人有做过成功了，但你们的overlap又不一样，结合强度又不单看碱基个数，还有gc含量、分步，以及所形成二级结构也是会影响的。
其次，你分别p那两个片段的时候，最后一步72度设置了多长时间？这一步确保片断末端完整性，所以也可以适当延长点，我一般都设10min，有时不急着用的话设个20min。不过这步应该也影响不大。估计还是重叠延伸第一步时出了问题。
以上个人浅见，仅供参考。晚上也要做第三个重叠延伸，然望一次就通过哈
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
18楼2012-03-29 17:41:58
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小猫三两只: 金币+2, ★有帮助, 这可也有可能，我扩增的几次结果都是300bp左右的带，估计就是第二个片段做模板加的多了 2012-03-30 16:06:22
上面都说了很多了，我就说一点。一般两个片段的摩尔比是1：1，但是也不绝对。如果PCR之后，看到两个片段中还是有一个比较亮，说明这个片段的量多了，下次可以把另一个片段的量加大点。
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19楼2012-03-29 17:52:30
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