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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 套叠PCR
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[求助] 套叠PCR

我想把基因内部的一段序列突变掉，采用套叠PCR的方法，两段PCR回收的大小分别为1400bp和200bp左右，但将这两段回收产物混合后作模板进行套叠，却怎么也扩不出目的带，请问是什么原因啊？我是大概按照浓度比1：1混合的，并且也试过不同体积的混合，结果都是一样，片段在250bp稍往上一点
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1楼 2012-03-27 12:38:44
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果子么么茶

木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-03-29 17:38:07
西瓜: 回帖置顶 2012-03-29 17:49:39
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-28 22:53:30:
得到的两个片段一个1400左右，一个200左右，浓度差不多。不加引物先循环是怎么回事，是将它们混合后作模板，不加引物配好体系按正常PCR程序进行15－20个循环，然后再拿出来加引物扩增吗？这样可以吗，你做过没

先对照marker 计算出质量浓度后 换成摩尔浓度 1:1  
不加引物先循环是让两个片段互为引物扩增 使重叠区更好的搭桥 得到特异性扩增 之后扩增更好将全长扩出 我试过 但引物问题 没有扩出来 此做法有相关文献报道 不一定15-20 循环 可以少些
重叠PCR能成功 有效退火很重要 可以尝试 TOUCHDOWN PCR
还有 你的重叠区是13bp？ 好短 能搭桥的上吗？
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13楼2012-03-29 09:27:22
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖提供有帮助的信息！ 2012-03-27 19:17:27
你说的应该是重叠延伸PCR吧，第二步PCR的确比较难P，原因也多种多样，我看你还是在退火温度上琢磨一下吧，试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析，原因太多。重叠部分过短，重叠部分有非特异性结合等等，爱莫能助！
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
2楼2012-03-27 13:12:15
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2012-03-27 13:12:15:
你说的应该是重叠延伸PCR吧，第二步PCR的确比较难P，原因也多种多样，我看你还是在退火温度上琢磨一下吧，试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析，原因太多。重叠部分过短，重叠部分有非特异性结 ...

是一个基因内缺失一段，用的基因内引物就把缺失的那段跨过去，扩增出两段后，再用全长基因的上下游引物，PCR混合产物作模板扩增。梯度我也试过，没什么效果
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3楼2012-03-27 15:50:13
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敏敏8305

铜虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 应助指数-1, 希望以后不应助的话，不要点应助哦 2012-03-29 10:26:22
请问楼主是做关于噬菌体展示技术方面的吗？
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My heart will go on!
4楼2012-03-27 18:10:25
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