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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 套叠PCR
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[求助] 套叠PCR

我想把基因内部的一段序列突变掉，采用套叠PCR的方法，两段PCR回收的大小分别为1400bp和200bp左右，但将这两段回收产物混合后作模板进行套叠，却怎么也扩不出目的带，请问是什么原因啊？我是大概按照浓度比1：1混合的，并且也试过不同体积的混合，结果都是一样，片段在250bp稍往上一点
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1楼 2012-03-27 12:38:44
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小猫三两只: 金币+2, ★有帮助, 这可也有可能，我扩增的几次结果都是300bp左右的带，估计就是第二个片段做模板加的多了 2012-03-30 16:06:22
上面都说了很多了，我就说一点。一般两个片段的摩尔比是1：1，但是也不绝对。如果PCR之后，看到两个片段中还是有一个比较亮，说明这个片段的量多了，下次可以把另一个片段的量加大点。
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19楼2012-03-29 17:52:30
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖提供有帮助的信息！ 2012-03-27 19:17:27
你说的应该是重叠延伸PCR吧，第二步PCR的确比较难P，原因也多种多样，我看你还是在退火温度上琢磨一下吧，试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析，原因太多。重叠部分过短，重叠部分有非特异性结合等等，爱莫能助！
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
2楼2012-03-27 13:12:15
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2012-03-27 13:12:15:
你说的应该是重叠延伸PCR吧，第二步PCR的确比较难P，原因也多种多样，我看你还是在退火温度上琢磨一下吧，试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析，原因太多。重叠部分过短，重叠部分有非特异性结 ...

是一个基因内缺失一段，用的基因内引物就把缺失的那段跨过去，扩增出两段后，再用全长基因的上下游引物，PCR混合产物作模板扩增。梯度我也试过，没什么效果
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3楼2012-03-27 15:50:13
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敏敏8305

铜虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 应助指数-1, 希望以后不应助的话，不要点应助哦 2012-03-29 10:26:22
请问楼主是做关于噬菌体展示技术方面的吗？
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My heart will go on!
4楼2012-03-27 18:10:25
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