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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的蛋白序列连接pet15b测序结果正确为何不表达
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lamprr

银虫 (初入文坛)

[求助] 目的蛋白序列连接pet15b测序结果正确为何不表达

最近作表达将质粒（测序结果正确）转入bl21中，摇菌2小时，加iptg1mM，37度4小时。没有任何特异条带，是怎么回事呢？请问菌种要求高么？我们的Bl21实验室用很久了，是不是菌种不行呢？还有什么因素应该考虑？请各位高手帮我分析一下，谢谢啦
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1楼 2012-03-02 11:19:46
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
诱导温度有点高，通常是30度左右，但不至于导致目标蛋白完全不表达，建议你将诱导后的菌体破碎离心，将上清和沉淀都跑胶看看，是不是有包涵体表达。祝好运！
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2楼2012-03-02 12:14:14
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lamprr

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-02 12:14:14:
诱导温度有点高，通常是30度左右，但不至于导致目标蛋白完全不表达，建议你将诱导后的菌体破碎离心，将上清和沉淀都跑胶看看，是不是有包涵体表达。祝好运！

我的处理方法是将菌体离心，用8m尿素溶液200微升溶解，一般处理过夜，再加上样缓冲液，按说包涵体都应该在里面啊
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3楼2012-03-02 17:12:04
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1, 专家考核): 2012-03-03 11:46:36
测序正确还要看看读码框对不对？读码框对了也不一定就能表达，还有mRNA的二级结构、要表达蛋白是否有毒性等也影响表达。
建议诱导后直接全细胞电泳，跑菌体蛋白，即使形成包涵体也能跑出来的，不用破碎后上清和沉淀分别跑胶，现在只是看有没有诱导表达而已。
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4楼2012-03-02 20:37:41
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lamprr(金币+2): 谢谢 你金币少 给你了 别人别有意见哦 2012-03-03 21:46:45
你确定你菌株酶问题？应该用BL21(DE3)，而不是BL21, 或者是其它含有DE3的菌株
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5楼2012-03-02 22:23:46
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whb21

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-02 12:14:14:
诱导温度有点高，通常是30度左右，但不至于导致目标蛋白完全不表达，建议你将诱导后的菌体破碎离心，将上清和沉淀都跑胶看看，是不是有包涵体表达。祝好运！

如果这样还是不见目标蛋白的话，建议你看看构建的工程菌是否有问题。
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6楼2012-03-05 10:51:47
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若水5886

新虫 (小有名气)
首先要看你的质粒有没有转入到合适的宿主菌中，如果质粒表达的是毒蛋白就要用BL21DE3。转化之后要PCR鉴定看看有没有转进去。
诱导表达的温度可以设置15，25，30几个梯度看看，还有就是设计引物的时候要注意核酸的个数，不要多或者少了让密码子错位，这样即使目的片段序列正确也没有目的蛋白表达出来。
最后跑电泳观察的时候最好是上清和沉淀都上样看看，确定蛋白在哪里
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7楼2012-03-05 11:21:12
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aleismile

银虫 (初入文坛)
你好，请问可以交流一下吗？我也在做这方面的内容！897748423
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8楼2013-11-27 23:55:44
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