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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为何PCR产物测序只测一部分？
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang

[求助] 为何PCR产物测序只测一部分？

想做一些看家基因分析，文献给的扩增引物和测序引物信息（位点）结果如下：
F:1162-1190      R:2126-2155  扩增产物994bp
F1:1273-1291    R1:2135-2152  测序产物879bp  实际测得540bp

问题一：为何测序只测PCR扩出来的一部分？如果本来只需这一小段的话为何不直接扩这一段？

问题二：根据测序引物的位点推测产物应该是879bp,为何实际测序结果是540bp?

很困惑，请教大虾！感激不尽！
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1楼 2012-02-22 23:06:29
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smilerion

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-23 08:16:07
因为扩增引物结合在模板上，测序引物是是结合在需要测序的PCR产物上的。
同时测序的结果在前100bp左右是不准的，一般不参考。
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2楼2012-02-23 02:56:50
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang
引用回帖:
2楼: Originally posted by smilerion at 2012-02-23 02:56:50:
因为扩增引物结合在模板上，测序引物是是结合在需要测序的PCR产物上的。
同时测序的结果在前100bp左右是不准的，一般不参考。

你的意思我明白，可我的问题还是没有搞明白
一般PCR产物测序就直接用PCR的引物测，可它这为何是在PCR的目的产物中间选的引物来测序？
测序前100bp确实不宜参考，可我看它那差的是300多bp啊？
为什么呢？
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3楼2012-02-23 09:34:26
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-24 15:18:57
首先要说明测序引物比扩增引物的要求要高，比如Tm值，GC含量，序列结构，要在保守区等，有时候设计扩增引物为了保证扩增出来的质量，不能和测序引物兼容。
其次，如果测出来的序列只有500多，那么你用扩增引物或者测序引物扩增出来的片段有多大？目标序列少很多肯定不对的
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4楼2012-02-23 10:17:25
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宝杰罗生物

捐助贵宾 (小有名气)
你扩增的PCR产物有问题，最少也能测到900bp；测序公司没给你测完，最好重新优化条件吧。
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5楼2012-02-23 11:57:45
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang
引用回帖:
4楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-23 10:17:25:
首先要说明测序引物比扩增引物的要求要高，比如Tm值，GC含量，序列结构，要在保守区等，有时候设计扩增引物为了保证扩增出来的质量，不能和测序引物兼容。
其次，如果测出来的序列只有500多，那么你用扩增引物或 ...

第一个问题明白了，谢谢！
第二个问题，先声明一下，我是看的参考文献，有些问题不明白自己还没开始做呢。我是根据它给的测序引物的位点来推测测出的序列应该是800多，可它的真正结果说只有500多，所以我不明白
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6楼2012-02-23 15:45:16
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 张晓梅ZXM at 2012-02-23 15:45:16:
第一个问题明白了，谢谢！
第二个问题，先声明一下，我是看的参考文献，有些问题不明白自己还没开始做呢。我是根据它给的测序引物的位点来推测测出的序列应该是800多，可它的真正结果说只有500多，所以我不明白

我不知道文献具体说的是什么情况，我是不是可以理解为文献说的目标序列其实是500多呢？测序的时候前后有部分序列不是目标序列的哦，比如说有一部分是载体序列，或者有一部分是测序引物和目标序列之间的序列。简言之，测序引物之间的800多个碱基只有中间的500多是目标序列，其他的不是目标序列而已。
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7楼2012-02-23 16:15:34
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海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个就要看你的文章里到底是怎样处理的，是什么目的了。
如果可以的话，可以把文献共享一下。这样会更有针对性。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
8楼2012-02-24 14:12:09
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang
引用回帖:
7楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-23 16:15:34:
我不知道文献具体说的是什么情况，我是不是可以理解为文献说的目标序列其实是500多呢？测序的时候前后有部分序列不是目标序列的哦，比如说有一部分是载体序列，或者有一部分是测序引物和目标序列之间的序列。简言 ...

800多是我根据测序引物推的，500多是它给的结果，你的说法应该是对的，800多当中只有500多是目的序列
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9楼2012-02-24 22:18:38
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang
引用回帖:
8楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-02-24 14:12:09:
这个就要看你的文章里到底是怎样处理的，是什么目的了。
如果可以的话，可以把文献共享一下。这样会更有针对性。

感兴趣的话可以看一下，也可能是我看文献时候信息没有领会全面，欢迎讨论和指教！
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  • 附件 1 : 2008_MLSA_for_Streptomycete_Systematics.pdf
    • 2012-02-24 22:21:16, 466.17 K
每天进步一点点，持之以恒！
10楼2012-02-24 22:22:01
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