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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang

[求助] 为何PCR产物测序只测一部分?

想做一些看家基因分析,文献给的扩增引物和测序引物信息(位点)结果如下:
F:1162-1190      R:2126-2155  扩增产物994bp
F1:1273-1291    R1:2135-2152  测序产物879bp  实际测得540bp

问题一:为何测序只测PCR扩出来的一部分?如果本来只需这一小段的话为何不直接扩这一段?

问题二:根据测序引物的位点推测产物应该是879bp,为何实际测序结果是540bp?

很困惑,请教大虾!感激不尽!
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 张晓梅ZXM at 2012-02-23 15:45:16:
第一个问题明白了,谢谢!
第二个问题,先声明一下,我是看的参考文献,有些问题不明白自己还没开始做呢。我是根据它给的测序引物的位点来推测测出的序列应该是800多,可它的真正结果说只有500多,所以我不明白

我不知道文献具体说的是什么情况,我是不是可以理解为文献说的目标序列其实是500多呢?测序的时候前后有部分序列不是目标序列的哦,比如说有一部分是载体序列,或者有一部分是测序引物和目标序列之间的序列。简言之,测序引物之间的800多个碱基只有中间的500多是目标序列,其他的不是目标序列而已。
7楼2012-02-23 16:15:34
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smilerion

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-23 08:16:07
因为扩增引物结合在模板上,测序引物是是结合在需要测序的PCR产物上的。
同时测序的结果在前100bp左右是不准的,一般不参考。
2楼2012-02-23 02:56:50
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang

引用回帖:
2楼: Originally posted by smilerion at 2012-02-23 02:56:50:
因为扩增引物结合在模板上,测序引物是是结合在需要测序的PCR产物上的。
同时测序的结果在前100bp左右是不准的,一般不参考。

你的意思我明白,可我的问题还是没有搞明白
一般PCR产物测序就直接用PCR的引物测,可它这为何是在PCR的目的产物中间选的引物来测序?
测序前100bp确实不宜参考,可我看它那差的是300多bp啊?
为什么呢?
每天进步一点点,持之以恒!
3楼2012-02-23 09:34:26
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-24 15:18:57
首先要说明测序引物比扩增引物的要求要高,比如Tm值,GC含量,序列结构,要在保守区等,有时候设计扩增引物为了保证扩增出来的质量,不能和测序引物兼容。
其次,如果测出来的序列只有500多,那么你用扩增引物或者测序引物扩增出来的片段有多大?目标序列少很多肯定不对的
4楼2012-02-23 10:17:25
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