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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

[交流] 合成一段DNA的问题？引物，PCR

想合成一段双链的DNA，大概50个BP，好像公司合的话价格稍高。
想设计成两段引物，想问下如果是两段互补DNA双链的话可以利用一定条件直接使其结合成双链吗？或是设计成两段有重叠的引物，互为模板，是否可行呢？条件大概怎么控制？
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1楼 2012-02-11 11:55:13
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
loveskyzhou(金币+1):谢谢参与
重叠延伸应该可行吧
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loveskyzhou
2楼2012-02-11 12:13:55
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wanhscn

木虫 (职业作家)
★
loveskyzhou(金币+1):谢谢参与
运气好的话，理论上可行！
运气不好，还是得不到你想要的。
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3楼2012-02-11 13:08:15
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by joan198108 at 2012-02-11 12:13:55:
重叠延伸应该可行吧

重叠延伸就是两段引物重叠相互P吧，可是这样做的话很难找到合适的Tm值啊，如果重叠过长Tm太高怎么P ？ 段的话又怕P不出来。。。。。
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4楼2012-02-11 13:29:57
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
loveskyzhou(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2012-02-11 19:57:01
loveskyzhou(金币+1): 2012-02-13 17:46:40
可以合成两段寡核苷酸单链（加上酶切位点），加上退火缓冲液后从94度降温到退火温度，连到载体上转化大肠杆菌，测序验证，可以引入新的酶切位点等。
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5楼2012-02-11 13:33:32
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by loveskyzhou at 2012-02-11 13:29:57:
重叠延伸就是两段引物重叠相互P吧，可是这样做的话很难找到合适的Tm值啊，如果重叠过长Tm太高怎么P ？ 段的话又怕P不出来。。。。。

总厂才50bp，我有同学合成过70bp的引物，据说最后目的条带扩增成功，所以重叠可以适当的长一些。关键是PCR后的目的条带比较短，所以电泳分离就比较麻烦，如何保证最终的产物都是延伸完全的，这是个问题。
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6楼2012-02-11 13:51:02
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fwks3518

木虫 (正式写手)
★
loveskyzhou(金币+1):谢谢参与
50bp，比引物长不了多少，那干脆按照引物合成算了，合成正反两条链，一搀和就双链了^_^
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7楼2012-02-11 15:19:02
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AnaSequence

金虫 (小有名气)
★
loveskyzhou(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
5楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-11 13:33:32:
可以合成两段寡核苷酸单链（加上酶切位点），加上退火缓冲液后从94度降温到退火温度，连到载体上转化大肠杆菌，测序验证，可以引入新的酶切位点等。

有些钱不能省的。至少要像这个专家说的做。小片段最好不要再做延伸了，直接合成两条链变性退火形成酶切位点的，退火后就连接吧。再加入其它对连接而言是杂质的试剂就要纯化，小片段很不好纯化的。
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8楼2012-02-11 20:52:48
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lizhaoge

铁虫 (初入文坛)
★
loveskyzhou(金币+1):谢谢参与
应该可行！PCR条件要跟碱基数目和种类来定，可以在通过软件确定
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9楼2012-02-11 22:08:24
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fooooooooox

新虫 (初入文坛)
★
loveskyzhou(金币+1):谢谢参与
合成两条30nt 单链，中间约10nt互补.加pcr酶，只用一个循环，延伸时间10分钟。要纯的话，可以3%胶回收。一般纯的话，用乙醇沉淀就可以了。
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10楼2012-02-12 00:07:19
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
loveskyzhou(金币+1):谢谢参与
loveskyzhou(金币+1): 2012-02-13 17:44:50
告诉你公司对这种小片段是怎么合成的：由于你要的DNA只有50bp，他们会先把这两条链分别合成（就当是合了两条50nt的引物，这个对于目前的技术非常容易实现），然后用这两条引物做个退火就OK了。这样得到的双链可以直接用来做连接或者PCR的模板
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11楼2012-02-12 09:26:16
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-11 13:33:32:
可以合成两段寡核苷酸单链（加上酶切位点），加上退火缓冲液后从94度降温到退火温度，连到载体上转化大肠杆菌，测序验证，可以引入新的酶切位点等。

是马上退到退火温度还是慢慢降温呢？
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12楼2012-02-13 17:47:09
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by loveskyzhou at 2012-02-13 17:47:09:
是马上退到退火温度还是慢慢降温呢？

可以用水浴锅，将温度升到94度后，光掉电源，让她慢慢降。。
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13楼2012-02-13 18:45:57
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生物一点点

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我说啊，就别那么折腾了，现有的基因合成技术很成熟价格也不高，那么点片段500大洋搞定了，何必去搞那些呢，就算你引物设计好啦，合成要50块钱吧，等你拿到货要2-3天时间吧，你摸条件需要消耗20大洋左右吧，结果还没出来一周时间没啦，就算你比较走运p出来的是你的目的条带，你也拿去车测序验证吧，片段太小还不能直接测序那需要做克隆吧200大洋有没啦，测序费需要25吧，合计一下：295，这是比较幸运的有1%的可能。要不成功重头再来一次，那就得花500多大洋啦。时间的损失呢老板可不会心疼你的。所以还直接扔给测序公司。。。。
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14楼2012-03-25 19:38:13
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