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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR无条带
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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR无条带

双酶切T载体和表达载体后，回收获得目的片段和载体，连接，转化，挑18个单克隆，菌落PCR全部无条带，这是怎么回事，目的片段确定酶切成功，表达载体无法从电泳图上确定是否两个位点都酶切成功（两个酶切位点紧连着）。可能是什么原因呢？
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1楼 2011-12-19 19:02:26
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xujie158

金虫 (小有名气)
我觉得是你酶切的问题，很可能是酶切不彻底，导致生长出的都是假阳性。
你说两个酶切位点间隔很近，你可以将质粒与酶切载体产物一起电泳，一般来说在电泳是泳动是会有不同的，这样可以帮助你确定载体酶切情况，并可以对载体进行酶切。
反正从现在的结果来看，你肯定是由于载体没切好造成的，你可以加一个载体上测序的引物PCR一下，看看是不是这个原因。
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15楼2011-12-27 16:41:00
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xujie158

金虫 (小有名气)
我觉得是你酶切的问题，很可能是酶切不彻底，导致生长出的都是假阳性。
你说两个酶切位点间隔很近，你可以将质粒与酶切载体产物一起电泳，一般来说在电泳是泳动是会有不同的，这样可以帮助你确定载体酶切情况，并可以对载体进行酶切后的回收。
反正从现在的结果来看，你肯定是由于载体没切好造成的，你可以加一个载体上测序的引物PCR一下，看看是不是这个原因。
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16楼2011-12-27 16:42:09
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xujie158

金虫 (小有名气)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流！ 2011-12-27 17:28:02
引用回帖:
5楼: Originally posted by 青菜小虫 at 2011-12-20 10:21:54:
菌落PCR太不可靠，我一般摇菌提质粒，质粒跑电泳大小合适的话，再做酶切验证，溶液ⅠⅡⅢ都是自己配的，实验都是很麻烦，想走捷径，就有不确定性。祝实验顺利。

菌P其实一般都是没有问题的，提质粒PCR只适合做平时小量的一个验证，假如你有大量的连接要做，你基本上就不能选择提质粒之后再PCR，因为太浪费时间，另外对于一些新手，辛辛苦苦提半天再没有，更容易打消积极性。再一方面，你提质粒就能保证没有不确定性吗？其实也是未必的。
我觉得菌P具有很多优势的。两个都是很好的选择，因人和项目而异吧。
不带攻击性，只是说出自己的看法，呵呵！
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17楼2011-12-27 16:48:45
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