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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：纯化蛋白遇到包涵体了，尿素怎么用？
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btx362237729

金虫 (正式写手)

[交流] 求助：纯化蛋白遇到包涵体了，尿素怎么用？

纯化大肠杆菌重组蛋白，遇到包涵体了，超声裂解不能澄清，离心后蛋白全在菌体沉淀里面

低温诱导貌似没什么效果。。。。。。请问大家用什么方法释放出来包涵体呢？

有人用8M尿素处理超声成功破裂包涵体

我的问题是，8M的尿素怎么去掉呢？我们的蛋白是GST标签的，是打算用GST琼脂糖柱子纯化的。。。。我不知道8M的尿素对柱子有没有什么影响呢？
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1楼 2011-10-04 13:12:26
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18853850850

金虫 (正式写手)
btx362237729(金币+3): 非常感谢 2011-10-04 13:36:46
amisking(BioEPI+1): 鼓励应助。 2011-10-04 18:51:24
上柱之前先进行包涵体的复性
（1）将溶解的包涵体装入已经处理好的透析袋中，封好口，。
（2）放于4℃复性缓冲液中进行梯度复性，间隔时间为10-12h，复性缓冲液的浓度分别为：4.5mmol/L、3.5mmol/L、2.5mmol/L、1.5mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L。
（3）取出复性后的蛋白溶液12000rpm离心20min，取上清，分别取少量的上清和少许的沉淀进行SDS-PAGE，检测复性情况。
复性缓冲液：PBS 1mmol/LEDTA +尿素
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2楼2011-10-04 13:16:47
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18853850850

金虫 (正式写手)
就是用透析法去除尿素。
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3楼2011-10-04 13:17:59
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btx362237729

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
amisking(金币+4): 鼓励应助。 2011-10-04 18:51:31
复性缓冲液的浓度分别为：4.5mmol/L、3.5mmol/L、2.5mmol/L、1.5mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L。

复性缓冲液：PBS 1mmol/LEDTA +尿素

抱歉这个浓度没看懂呢，是指的尿素的浓度吗？

听说尿素处理后GST标签蛋白的结构被破坏得很严重，复性效果也不好，不知道是不是真的？

复性就指去除尿素，然后蛋白质自己折叠？导师说我们这个蛋白就是个直的，不需要折叠，那么主要就要复性GST了
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4楼2011-10-04 13:30:32
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18853850850

金虫 (正式写手)
上面的浓度是尿素的浓度，去除尿素之后蛋白就会按照最稳定的形态去折叠，主要是而二硫键的作用，GST标签很大，你的蛋白是直的，也有天然构象，要去除尿素。谢谢你有金币。
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5楼2011-10-04 15:09:14
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 18853850850 at 2011-10-04 15:09:14:
上面的浓度是尿素的浓度，去除尿素之后蛋白就会按照最稳定的形态去折叠，主要是而二硫键的作用，GST标签很大，你的蛋白是直的，也有天然构象，要去除尿素。谢谢你有金币。

复性的过程太费时间了
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6楼2011-10-04 22:43:30
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18853850850

金虫 (正式写手)
可是你不用管，过段时间换液就行了
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7楼2011-10-05 09:11:47
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 18853850850 at 2011-10-05 09:11:47:
可是你不用管，过段时间换液就行了

我试试不复性直接挂柱子看能不能行。。。我用的3M尿素试试  哎
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8楼2011-10-05 13:28:34
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youngker918

金虫 (正式写手)
你可以先透析去除尿素再过柱子的
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9楼2011-10-05 20:10:50
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by youngker918 at 2011-10-05 20:10:50:
你可以先透析去除尿素再过柱子的

恩啊 也许只能这样干了。。。。。。。。。
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10楼2011-10-05 23:45:35
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rhguo

铜虫 (小有名气)
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低温诱导可溶性表达的确不靠谱，我都到24度了，包涵体里面的还是非常浓，上清非常少
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11楼2012-04-27 17:17:53
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4545822楼: Originally posted by rhguo at 2012-04-27 17:17:53:
低温诱导可溶性表达的确不靠谱，我都到24度了，包涵体里面的还是非常浓，上清非常少

24度真的不算低。。。我最终15度。。。出来了很多
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12楼2012-04-27 19:11:10
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rhguo

铜虫 (小有名气)
★
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15度，这也太夸张了吧，这么低温度，诱导时间呢？
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13楼2012-04-28 13:09:07
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★
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14楼2012-05-10 09:14:44
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花生剥了壳

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
谢谢！
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15楼2012-05-10 11:24:57
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4546852楼: Originally posted by rhguo at 2012-04-28 13:09:07:
15度，这也太夸张了吧，这么低温度，诱导时间呢？

诱导14小时
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16楼2012-05-12 21:34:00
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yylc1840

铜虫 (小有名气)
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不去除尿素挂柱肯定是不行的
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17楼2012-06-11 21:25:30
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XXXX1997

新虫 (小有名气)
★
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送红花一朵
楼主，我是药剂专业的不太懂，想请教一下，尿素在提取蛋白过程中有什么作用呀，为什么一开始有尿素，最后又要除去呢，能够解答的话真的非常感谢
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18楼2022-08-05 00:19:55
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