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btx362237729

金虫 (正式写手)

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虫号: 1069351

[交流] 求助：纯化蛋白遇到包涵体了，尿素怎么用？

纯化大肠杆菌重组蛋白，遇到包涵体了，超声裂解不能澄清，离心后蛋白全在菌体沉淀里面

低温诱导貌似没什么效果。。。。。。请问大家用什么方法释放出来包涵体呢？

有人用8M尿素处理超声成功破裂包涵体

我的问题是，8M的尿素怎么去掉呢？我们的蛋白是GST标签的，是打算用GST琼脂糖柱子纯化的。。。。我不知道8M的尿素对柱子有没有什么影响呢？

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1楼 2011-10-04 13:12:26

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btx362237729

金虫 (正式写手)

应助: 18 (小学生)
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帖子: 745
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虫号: 1069351

★ ★ ★ ★
amisking(金币+4): 鼓励应助。 2011-10-04 18:51:31

复性缓冲液的浓度分别为：4.5mmol/L、3.5mmol/L、2.5mmol/L、1.5mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L。

复性缓冲液：PBS 1mmol/LEDTA +尿素

抱歉这个浓度没看懂呢，是指的尿素的浓度吗？

听说尿素处理后GST标签蛋白的结构被破坏得很严重，复性效果也不好，不知道是不是真的？

复性就指去除尿素，然后蛋白质自己折叠？导师说我们这个蛋白就是个直的，不需要折叠，那么主要就要复性GST了

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4楼2011-10-04 13:30:32

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18853850850

金虫 (正式写手)

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虫号: 1189069

btx362237729(金币+3): 非常感谢 2011-10-04 13:36:46
amisking(BioEPI+1): 鼓励应助。 2011-10-04 18:51:24

上柱之前先进行包涵体的复性
（1）将溶解的包涵体装入已经处理好的透析袋中，封好口，。
（2）放于4℃复性缓冲液中进行梯度复性，间隔时间为10-12h，复性缓冲液的浓度分别为：4.5mmol/L、3.5mmol/L、2.5mmol/L、1.5mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L。
（3）取出复性后的蛋白溶液12000rpm离心20min，取上清，分别取少量的上清和少许的沉淀进行SDS-PAGE，检测复性情况。
复性缓冲液：PBS 1mmol/LEDTA +尿素

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2楼2011-10-04 13:16:47

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