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btx362237729

金虫 (正式写手)


[交流] 求助:纯化蛋白遇到包涵体了,尿素怎么用?

纯化大肠杆菌重组蛋白,遇到包涵体了,超声裂解不能澄清,离心后蛋白全在菌体沉淀里面

低温诱导貌似没什么效果。。。。。。请问大家用什么方法释放出来包涵体呢?

有人用8M尿素处理超声成功破裂包涵体

我的问题是,8M的尿素怎么去掉呢?我们的蛋白是GST标签的,是打算用GST琼脂糖柱子纯化的。。。。我不知道8M的尿素对柱子有没有什么影响呢?
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18853850850

金虫 (正式写手)


上面的浓度是尿素的浓度,去除尿素之后蛋白就会按照最稳定的形态去折叠,主要是而二硫键的作用,GST标签很大,你的蛋白是直的,也有天然构象,要去除尿素。谢谢你有金币。
5楼2011-10-04 15:09:14
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18853850850

金虫 (正式写手)


btx362237729(金币+3): 非常感谢 2011-10-04 13:36:46
amisking(BioEPI+1): 鼓励应助。 2011-10-04 18:51:24
上柱之前先进行包涵体的复性
(1)将溶解的包涵体装入已经处理好的透析袋中,封好口,。
(2)放于4℃复性缓冲液中进行梯度复性,间隔时间为10-12h,复性缓冲液的浓度分别为:4.5mmol/L、3.5mmol/L、2.5mmol/L、1.5mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L。
(3)取出复性后的蛋白溶液12000rpm离心20min,取上清,分别取少量的上清和少许的沉淀进行SDS-PAGE,检测复性情况。
复性缓冲液:PBS 1mmol/LEDTA +尿素
2楼2011-10-04 13:16:47
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18853850850

金虫 (正式写手)


就是用透析法去除尿素。
3楼2011-10-04 13:17:59
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btx362237729

金虫 (正式写手)


★ ★ ★ ★
amisking(金币+4): 鼓励应助。 2011-10-04 18:51:31
复性缓冲液的浓度分别为:4.5mmol/L、3.5mmol/L、2.5mmol/L、1.5mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L。

复性缓冲液:PBS 1mmol/LEDTA +尿素

抱歉这个浓度没看懂呢,是指的尿素的浓度吗?

听说尿素处理后GST标签蛋白的结构被破坏得很严重,复性效果也不好,不知道是不是真的?

复性就指去除尿素,然后蛋白质自己折叠?导师说我们这个蛋白就是个直的,不需要折叠,那么主要就要复性GST了
4楼2011-10-04 13:30:32
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