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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】急！如何分离未彻底破碎的细胞及包涵体？
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安静的位置i

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】急！如何分离未彻底破碎的细胞及包涵体？

大肠杆菌诱导表达后，重组蛋白有部分可溶，部分不可溶；而超声破碎率无法达到100%，因此当离心后，沉淀部分既有不可溶蛋白，也有未破碎的细胞，如果不去除未破碎的细胞，通过SDS-PAGE看到的胞浆与沉淀的蛋白条带的比例就是不可信的。如何分离这两部分呢？

以下是我目前的实验操作：
1.  100mL菌液，收集后用缓冲液浓缩为10mL左右（湿菌体密度50mg/mL），超声破碎条件（200w,5s,5s,30min)，10000g离心15min，上清与沉淀分别电泳检测。
结果：沉淀部分电泳后条带也很多较浓，与上清相似或稍浅些，按常理，大肠杆菌中的天然蛋白应该都是可溶的，所以沉淀中应该没有多少条带，由此，我推测超声破碎不彻底，有未破碎细胞混入。
2.  后来我又尝试将破碎后的菌体，3000g离心10min，取上清，再将上清，15000g离心10min，此时得到的上清和沉淀（非常少，几乎看不到）分别电泳检测，
结果：沉淀部分几乎没有条带，上清部分有条带，但是都比之前浅和很多。沉淀部分几乎没有条带说明几乎没有不可溶的重组蛋白，但这是不可能的，因为有许多文献报道这个蛋白在大肠杆菌中表达的大部分都是不可溶蛋白，少量是可溶的。所以我推测这次我又将不可溶蛋白和未破碎菌体都离心后去掉了。

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1楼 2011-01-10 16:47:31
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天使托

专家顾问 (职业作家)
遇到包涵体就很难办了！期待高手！
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2楼2011-01-10 17:07:20
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
分离未彻底破碎的细胞及包涵体的目的是为了获得纯净的包涵体，然后重折叠么？
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3楼2011-01-10 17:19:32
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安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-10 17:19:32:
分离未彻底破碎的细胞及包涵体的目的是为了获得纯净的包涵体，然后重折叠么？

是通过SDS-PAGE，能够清楚判断可溶性蛋白和包涵体的大致比例。
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4楼2011-01-11 12:24:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by 安静的位置i at 2011-01-11 12:24:59:

是通过SDS-PAGE，能够清楚判断可溶性蛋白和包涵体的大致比例。

分开来回收纯化不就完事儿了么，我觉得你把自己绕进去了，都远离了自己的目的。
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5楼2011-01-11 12:29:29
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安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-11 12:29:29:



分开来回收纯化不就完事儿了么，我觉得你把自己绕进去了，都远离了自己的目的。

包涵体的回收纯化是先要通过尿素溶解吧？可是这样未破碎的细胞也会溶解，里面的蛋白被释放，最后还是无法分清哪些是可溶的 哪些是包涵体啊。
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6楼2011-01-11 18:47:57
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安静的位置i

金虫 (小有名气)
要不我换个问法，如何才能彻底将大肠杆菌破碎，而蛋白不变性，除了超声破碎，还有哪些好方法？温和而有效。如果超声破碎，还有哪些小技巧可以借鉴？
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7楼2011-01-11 18:49:18
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qqm8445

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我是超声30min 后，再用曲通100，洗2次，2M尿素洗2次，最后的沉淀用8M尿素溶解，再跑杂带就很少了，和我的目的蛋白分得很开了，你多洗洗试试吧
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8楼2012-02-28 21:31:46
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