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[交流]
【求助/交流】急！如何分离未彻底破碎的细胞及包涵体？
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大肠杆菌诱导表达后，重组蛋白有部分可溶，部分不可溶；而超声破碎率无法达到100%，因此当离心后，沉淀部分既有不可溶蛋白，也有未破碎的细胞，如果不去除未破碎的细胞，通过SDS-PAGE看到的胞浆与沉淀的蛋白条带的比例就是不可信的。如何分离这两部分呢？ 以下是我目前的实验操作： 1. 100mL菌液，收集后用缓冲液浓缩为10mL左右（湿菌体密度50mg/mL），超声破碎条件（200w,5s,5s,30min)，10000g离心15min，上清与沉淀分别电泳检测。 结果：沉淀部分电泳后条带也很多较浓，与上清相似或稍浅些，按常理，大肠杆菌中的天然蛋白应该都是可溶的，所以沉淀中应该没有多少条带，由此，我推测超声破碎不彻底，有未破碎细胞混入。 2. 后来我又尝试将破碎后的菌体，3000g离心10min，取上清，再将上清，15000g离心10min，此时得到的上清和沉淀（非常少，几乎看不到）分别电泳检测， 结果：沉淀部分几乎没有条带，上清部分有条带，但是都比之前浅和很多。沉淀部分几乎没有条带说明几乎没有不可溶的重组蛋白，但这是不可能的，因为有许多文献报道这个蛋白在大肠杆菌中表达的大部分都是不可溶蛋白，少量是可溶的。所以我推测这次我又将不可溶蛋白和未破碎菌体都离心后去掉了。 请高人指点！ |
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