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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR问题
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madengyu

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【分子生物】EPI帖

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1楼 2011-08-26 09:35:00
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!我们也是挑的菌落，比较省事。 2011-08-26 11:43:50
madengyu(金币+2): 2011-08-26 11:48:38
楼主做菌液PCR验证克隆的话，其实可以这样！
首先根据你描述的体系，模板有些多了，
其实你不用那菌液当模板的，将疑似单克隆划到平板上（一个平板可以划很多），然后挑菌进行裂解，用裂解的菌液当模板，这样岂不是很方便？如果你摇菌的话，确实有些麻烦和费事，如果有疑似10个正确的单克隆，你难道还接10管菌？
我们这里都是挑菌裂解进行PCR验证的，
当然了PCR验证只是一个初步验证连接的检验方法，如果能P出来，那么基本就对了，这时候就需要提个质粒，酶切一下就OK了，国际上还是比较认可酶切的；
当然了没有P出来并不代表没有连接上，有可能是你的PCR问题。。。
所以提取质粒进行酶切还是后期必须的。。。
祝好运！
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7楼2011-08-26 11:29:47
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shuihaizi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我认为你的模板量太大了 ，我做10ul体系的，过夜摇菌，只用0.2ul足够了，效果挺好的。
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2楼2011-08-26 09:50:25
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

你做菌液PCR是想干什么？扩载体上的一段序列还是什么？
还是做克隆验证呢？
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3楼2011-08-26 10:24:49
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madengyu

禁虫 (小有名气)
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4楼2011-08-26 10:26:58
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你的胶图中连一点抹带都没有，Marker后面三孔最下端隐约还能看到引物二聚体的影子，我怀疑是模板有问题，就是说假阳性或者摇的菌出了问题（有沉淀，一般刚摇完的菌是没有沉淀的）。
    下次做菌液pcr的时候最好拿个已知的目的基因做个正对照，这样就可以排除pcr体系和程序的问题，因为菌液pcr影响因素蛮多的。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
5楼2011-08-26 10:42:48
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arniekyo

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

提取质粒验证一下，就知道是模板的问题还是菌的问题，这样以后做的话心里也有底了，只是个人意见
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6楼2011-08-26 11:22:52
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-26 11:29:47:
楼主做菌液PCR验证克隆的话，其实可以这样！
首先根据你描述的体系，模板有些多了，
其实你不用那菌液当模板的，将疑似单克隆划到平板上（一个平板可以划很多），然后挑菌进行裂解，用裂解的菌液当模板，这样岂 ...

我们也是用菌落，但是没有另外做裂解，而是直接把菌用牙签或枪头挑到3微升水里面作为模板。我们实验室做PCR预变性一般是95℃/5分钟，这个条件已经足以让菌体裂解了。
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8楼2011-08-26 11:47:05
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
8楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-08-26 11:47:05:
我们也是用菌落，但是没有另外做裂解，而是直接把菌用牙签或枪头挑到3微升水里面作为模板。我们实验室做PCR预变性一般是95℃/5分钟，这个条件已经足以让菌体裂解了。

我们变性是95度15min。。。。
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西瓜
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9楼2011-08-26 12:03:24
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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引用回帖:
9楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-26 12:03:24:
我们变性是95度15min。。。。

我回头check下，貌似5min是不够……
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10楼2011-08-26 12:26:12
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