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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 毕赤酵母发酵上清液——脱色素？？
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erluoshi

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1楼 2011-08-17 15:39:19
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
活性炭吸附，离心去除活性炭
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-08-17 16:12:25
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
3楼: Originally posted by ganchao1776 at 2011-08-17 22:46:40:
活性碳也吸蛋白的吧！！建议你用超滤的方法吧，可以同时置换缓冲液和浓缩

活性炭确实也吸附蛋白质的，但很多方法都会造成蛋白质的损失，另外，楼主说的是“细胞外产物”，不知道是蛋白质还是什么东西，要是分子量比较小，你的超滤就不起作用了。
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4楼2011-08-18 00:15:50
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+9, MicEPI+1): xxrxjl o~ 2011-08-19 00:12:56
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2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-08-17 16:12:25:
活性炭吸附，离心去除活性炭

活性炭品牌不同，孔径也不同，吸附的物质大小也不同，但是很多厂家都不在外包装上标明的。

我曾经使用过几种活性炭来吸附我的粗酶液中的色素，但是效果都不算太好，酶活力会有损失。吸附时间久了，会把酶也吸附，我试过吸附10分钟和过夜的，结果过夜的酶损失稍大。

由于色素不重，所以加2%（W/V）处理，结果有一种活性炭可以去除一半色素，酶损失5%。由于活性炭也会占体积，所以如果用量太大，吸附的蛋白质会更多，所以别加太多。

由于活性炭不能经由离心完全去除，会造成OD600提高，所以从图中可以看出有的处理是OD600比原来酶液还高的。离心后用滤膜过滤，能把活性炭颗粒除去，OD600就会进一步下降。

我的对照为“原酶液不添加活性炭”，使用的活性炭分别为“粒状（天津市北长方正试剂厂，500g）”、“汕头市达濠精细化学品，500g”、“广东省台山市化工厂，500g，批号20080501”、“糖用活性炭”，如果你能买得到多个品种的活性炭，不妨也做一下我的这个实验。
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12楼2011-08-18 23:53:26
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5, MicEPI+1): 经验最重要 2011-08-19 00:29:14
erluoshi(金币+5): 2011-08-20 15:01:42
引用回帖:
12楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-08-18 23:53:26:
活性炭品牌不同，孔径也不同，吸附的物质大小也不同，但是很多厂家都不在外包装上标明的。

我曾经使用过几种活性炭来吸附我的粗酶液中的色素，但是效果都不算太好，酶活力会有损失。吸附时间久了，会把酶也吸 ...

关于用分子筛来去除色素，我觉得色素可以是无机物也可以是有机物，分子量可以从100到上万，所以不一定可以与酶分得开。我曾经用G75来纯化我的淀粉酶，结果发现淀粉酶不能与色素完全分开，说明粗酶液里含有多种色素，且分子量不一，大分子量的色素与淀粉酶不能分开，小分子量的可以分开。不知道楼主的色素种类和分子量，所以不知道如果用分子筛结果会如何，但楼主可以试一下。
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13楼2011-08-19 00:20:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
为什么对这个色素问题这么纠结呢？
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14楼2011-08-19 00:31:03
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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
rainwander(金币+5, MicEPI+1): 鼓励 2011-09-01 17:33:32
引用回帖:
1楼: Originally posted by erluoshi at 2011-08-17 15:39:19:
大家好，请教思路
    毕赤酵母上罐发酵生产细胞外产物，得到了广泛的应用。我用无机培养基上罐发酵，得到的是黄绿色的发酵上清液，经过了分离柱的分离纯化，色素还是存在。
    色素成分有谁研究了解没？
  ...

对于我的淀粉酶来说，第一步如果用疏水层析可以去除绝大部分的色素。

粗酶液经过2M硫酸铵处理4℃静置过夜，8000RPM离心去沉淀，上清液的pH值调节为4.0于4℃静置过夜，8000RPM离心去沉淀，上清液的pH值调节为6.5，依次用0.45μm和0.22μm滤膜过滤，用HiPrep Phenyl cv=20ml进行蛋白质分离（程序为20mM磷酸钠缓冲液、2M硫酸铵、20cv、0-100%B、流速5ml/min）（图1）。

由于样品多达200ml，所以穿透液较多，每管为15ml，而洗脱液为每管5ml。测定各管OD600表示颜色深浅（图3），将淀粉酶所在的收集管（淀粉酶在洗脱液中的分布图2）合并后也测定OD600，结果以原酶液作为100%，则穿透液占51.71%，其它洗脱液占32.14，淀粉酶所在的洗脱液占13.39，可见能去掉绝大部分的色素（图4）。
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19楼2011-09-01 03:38:43
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生物大分子降解酶

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★ ★ ★ ★ ★
rainwander(金币+5, MicEPI+1): 鼓励 2011-09-01 17:33:41
引用回帖:
1楼: Originally posted by erluoshi at 2011-08-17 15:39:19:
大家好，请教思路
    毕赤酵母上罐发酵生产细胞外产物，得到了广泛的应用。我用无机培养基上罐发酵，得到的是黄绿色的发酵上清液，经过了分离柱的分离纯化，色素还是存在。
    色素成分有谁研究了解没？
  ...

将上述洗脱液中淀粉酶活力明显的洗脱液合并，脱盐，用HiTrap Q CV=1ml 强阴离子交换层析（程序为20mM Tris-HCl缓冲液、1M NaCl、40cv、0-100%B、流速1ml/min、洗脱收集液为每管2ml）（图1），可以看出淀粉酶所处的洗脱液（图2）中色素较少（图3），蛋白质也还没到最大量被洗脱的时候，还是有一些分离效果的。
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20楼2011-09-01 03:57:23
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