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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做克隆出了很诡异的问题
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mengxibio

新虫 (小有名气)

[交流] 做克隆出了很诡异的问题 已有9人参与

在做克隆，向感受态细胞导入载体出问题了。
向感受态细胞导入载体（上有抗amp位点，以及蓝白斑的位点）
结果，negative（纯的感受态细胞，没有导入载体）上出现大量蓝斑，而且其他几板普遍出现大量蓝斑，白斑几乎没有
之后我做菌落pcr，证明包括negative和其他几板上的蓝斑菌的确没有导入载体

问题是什么，操作上绝没有问题，我和另外一个人先后做了两遍，同样的结果

现在就怀疑是感受态细胞的问题，是一个师兄自己做的。但是这样的感受态细胞也太可怕了吧，不包括载体（已经用引物，做pcr证明），但是却含有抗amp基因，含有蓝白斑所需的基因

大家认为什么原因呢，排除操作上的原因
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1楼 2011-08-09 11:22:07
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
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从其他公司买几支感受态试试
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2011-08-09 12:26:33
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mengxibio

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-09 12:26:33:
从其他公司买几支感受态试试

已经订了生工的成品，然后做下看看，估计就是感受态的问题
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3楼2011-08-09 12:57:46
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wzqno

金虫 (小有名气)
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西瓜(金币+1): 有可能 2011-08-10 17:58:38
是不是板子的amp失效了，再说了可以自己做感受态细菌啊，没啥难度啊
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4楼2011-08-09 13:49:47
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anlewo7777

木虫 (正式写手)
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1949stone(金币+3): 有见地 2011-08-09 16:58:13
感受态细菌菌株应该是半乳糖苷酶缺陷型菌株，因为导入的质粒引入了菌体缺失的一条半乳糖苷酶肽段，和菌株有的一个肽段互补而有半乳糖苷酶活性，从而降解X-gal产生蓝色。你要是想查原因，可以看你的感受态菌株的说明，看是不是半乳糖苷酶缺陷型
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5楼2011-08-09 14:06:41
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mengxibio

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wzqno at 2011-08-09 13:49:47:
是不是板子的amp失效了，再说了可以自己做感受态细菌啊，没啥难度啊

没有失效，这个肯定的。最近时间紧迫，想尽快结束实验
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6楼2011-08-09 16:38:26
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mengxibio

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by anlewo7777 at 2011-08-09 14:06:41:
感受态细菌菌株应该是半乳糖苷酶缺陷型菌株，因为导入的质粒引入了菌体缺失的一条半乳糖苷酶肽段，和菌株有的一个肽段互补而有半乳糖苷酶活性，从而降解X-gal产生蓝色。你要是想查原因，可以看你的感受态菌株的说 ...

蓝白斑原理我懂的。用的感受态是一个师兄自己做的。我们实验室是这样，做感受态时做一大批，实验室共用
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7楼2011-08-09 16:40:06
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)
★
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阴性变蓝的确说不过去，怎么感受态里面难道本来就有自连的T载体？很诡异，既然你操作没问题只能换感受态了。
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8楼2011-08-09 17:07:07
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wzqno

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
6楼: Originally posted by mengxibio at 2011-08-09 16:38:26:
没有失效，这个肯定的。最近时间紧迫，想尽快结束实验

你们实验室有没有DH5a大肠杆菌或者top10啊？？还是自己做感受态吧，转化效率也可以很高的
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9楼2011-08-09 17:32:16
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weiwei888

禁虫 (小有名气)
★
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10楼2011-08-09 17:57:56
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