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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞培养相关问题 急！！！！！
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luolh2004

金虫 (著名写手)

[求助] 细胞培养相关问题 急！！！！！

各位虫友们好啊，我现在进行Balb/c3T3细胞培养实验，现在遇到一系列麻烦事，特地向大家请教，谢谢了哦。
1.细胞培养使用的双抗溶液（购买的），有效期已经过了，还能够使用吗？因为没有注意到，我已经用了好长一段时间了。同样，如果类似R1640和DMEM培养基过期了，是不是就不能继续使用了？
2.近期发现细胞状态非常不好，有很多死细胞，不管是刚复苏的细胞还是已经复苏一段时间的细胞，死细胞都很多。细胞生长速度没受什么影响，算是比较正常，就是不知道为什么会有那么多死细胞，实在是找不出什么原因。
3.我目前正在做hegf表皮细胞生长因子活性检测实验，使用的方法是MTT法，细胞是Balb/c3T3细胞，但是每次做的实验结果都发现，加入生长因子样品和标准品的数值没有维持培养基的高。希望有同样做这个实验的虫友们，给点意见，或者是有机会大家多多交流下，谢谢了。
     MTT实验我已经做了大半年了，中间总是不断有问题出现，现在还是没有能完成，非常着急，有做过类似实验的虫友们，一定要帮帮我呀，非常感谢了！
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努力修炼，等待升级！
1楼2011-07-23 18:40:37
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hgq115

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+20): 谢谢，说的挺有用的 2011-07-25 20:11:51
1、双抗过期影响不大的，只要不污染就行了，但是培液过期建议最好不用，本人发现过期培液容易造成pH不稳定，会对细胞生长造成很大影响。
2、我以前也出现过这样的问题，这应该是细胞自身的关系，很有可能是细胞在冻存的时候出现了问题，多传代几次后会慢慢减少。
3、我没做过MTT用来检测细胞因子活性的实验，但是做过很多检测细胞毒性和杀伤力的实验，本人觉得做MTT有以下几点特别需要注意：1. 加MTT时注意枪头不能插到孔底，免得损伤细胞，2、倒培液是要倒均匀，用枪吸的时候很容易导致细胞被吸走或者吸不均匀，我们自创了一种办法是将96孔板倒置在吸水纸上，再将96空斑倾斜几次，这样能比较均匀的吸走培液，效果挺不错。
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5楼2011-07-25 08:29:48
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sdjean521

铜虫 (小有名气)
其他的就不说了，我以前本来也要做MTT的，后来因为看见有直接的细胞计数和细胞毒性试剂盒，就直接买来用了，个人感觉很好用，当时是买的cck-8试剂盒，同仁化学研究所（Dojindo Laboratories ）公司的，用起来比较方便，也不是很贵，当然比起MTT试剂是贵了点，呵呵，不知道这对楼主有没有帮助
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luolh2004
加油加油加油！！！
11楼2013-03-09 23:10:26
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浪人利利

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+15): 非常感谢，我也有点怀疑是冻存的问题。我的是贴壁细胞，可以把上清去掉，还是谢谢你的回答 2011-07-24 23:54:10
1、不过期最好了，双抗过期不很久也没关系，培养基最好不要用过期的
2、通过你的描述，个人觉得你冻存的细胞可能都有问题（或者中间液氮干掉了，没及时补充）
3、没怎么理解你的意思

个人建议：细胞重新复苏，培养液重新制取，稍微比平时多加一点血清试试；细胞有碎片或者死细胞就及时PBS多洗几次，勤换培养液；虽然你的意思我没完全明白，但是MTT法测定时，96孔板我一般都不把培养液倒掉（防止悬浮细胞倒掉了），直接加MTT、DMSO等处理，然后震荡后直接测定数值；以上仅供参考
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2楼2011-07-23 23:32:10
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lw582482481

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+20): 谢谢你的回答，对我挺有用处的，建议也很好。 2011-07-24 23:56:12
1  双抗过期是没有问题的。低温保存适当的情况下没有差别。培养基过期的话，如果你买的是液体培养基，建议不要用了。如果是固体粉末自己配培养基，没有多大问题。
2  复苏之后死细胞过多，这个是你的细胞状态不好。也许是你在细胞长的过多的时候传代，这样不好（虽然没有养过你这种细胞）。另外就是可能你细胞在消化的时候受损严重，会有部分细胞死亡。而由于你细胞自身长的速度比较快，整体来说不受影响。
3  mtt不知道是啥？但是关于你的EGH的测定我想，这个蛋白是分泌型的，你在测数值的时候是否没有把胞外的那部分没有测定呢？
4  关于你试验的问题，你的对照以及实验组是否完全一致，这个十分重要。二者的细胞密度以及生长条件之类的都很有影响。
    最后，我建议你是在细胞状态调整好之后再做吧。因为细胞死的多，肯定是有问题的。在细胞生长得最旺盛的时候传代但是不能过多或者过少。维持2-6d传一次最好。还有细胞的消化一定要适当。
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30而立
3楼2011-07-24 09:34:26
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aegeansyang

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+10): 我培养的是小鼠胚胎成纤维细胞，是贴壁的细胞，刚复苏的时候死细胞很多，复苏一段时间后死细胞就比较少点，但是还是觉得不正常的，死细胞比较多点 2011-07-24 23:58:09
不知你细胞是接种的时候就出现大量的不贴壁细胞呢，还是培养一段时间后开始出现细胞死亡呢？
如果是前者，可能你的消化过程存在问题；而后者的话可能是培养基有问题了
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4楼2011-07-24 15:05:09
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xiaoxiangtu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+10): 就是因为影响因素太多，所以现在实验结果都不理想，想找做过类似实验的人多交流下 2011-07-25 20:12:53
MTT影响因素太多了，细胞自身生长状态，细胞接种量也很影响结果的。
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6楼2011-07-25 09:12:52
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yangl6033

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+5): 谢谢回帖交流 2011-07-26 08:06:25
本人感觉不管培养基过期不过期，最好是新鲜的，就是配制好再一两月之内用完，不然有可能pH变化，这对细胞的伤害是致命的，再说越是过期污染的几率越大。
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空有凌云志恨无登天梯！-自寻梯子，哈哈！
7楼2011-07-25 20:59:13
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+15): 谢谢交流回帖，我觉得你们的意见都很好，可能是我描述太简单了，等有机会再做个详细描述吧 2011-07-30 10:54:13
1 双抗过期也没事的，medium过期的就别用了
2 就算再好的冻存条件，刚复苏的第一代细胞也必然有很多死的，第二代时也会残留一些。多传几代就好了。只要活细胞生长速度没影响就没大问题，忍受不了的话就等状态好了之后再重新冻存一批好了。
3 MTT的手技要求很高的，个人感觉是一个重复性较差的实验方法。你必须保证用于实验的各组细胞和各批次细胞尽量处于同一的状态。比如都是从stock中用同样方式复苏同样代数的细胞。而且MTT的几次换液操作也要尽量统一，尽量快，最好是用排枪。MTT时尽量不要用整块96孔板，用中央的25个左右效果最好。这样才能尽可能的保证重复性。至于对照组和处理组之间的差别，只要重复性能够实现，你就应该尊重实验事实，去找可能的原因。
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摒气动方息，宁神心自明。
8楼2011-07-26 10:11:03
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+5): 谢谢回帖交流 2011-07-30 10:54:29
忘记一点，你的生长因子处理组和对照组必须用同样的换液操作，也就是说你生长因子处理的时候，对照组要用不含生长因子的buffer进行同样的换液操作，如果对照组不做对照操作的话，生长因子处理过程中损失的细胞将无法扣除。
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摒气动方息，宁神心自明。
9楼2011-07-26 10:12:30
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kechong

木虫 (正式写手)
MTT重复性比较差，细胞最好在对数生长期接入，你看一下你的对照组，OD不是很高的话就说明细胞活力不好，这样很难做出与实验组差异的结果。
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10楼2012-03-21 14:11:41
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