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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞培养相关问题 急！！！！！
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luolh2004

金虫 (著名写手)

[求助] 细胞培养相关问题 急！！！！！

各位虫友们好啊，我现在进行Balb/c3T3细胞培养实验，现在遇到一系列麻烦事，特地向大家请教，谢谢了哦。
1.细胞培养使用的双抗溶液（购买的），有效期已经过了，还能够使用吗？因为没有注意到，我已经用了好长一段时间了。同样，如果类似R1640和DMEM培养基过期了，是不是就不能继续使用了？
2.近期发现细胞状态非常不好，有很多死细胞，不管是刚复苏的细胞还是已经复苏一段时间的细胞，死细胞都很多。细胞生长速度没受什么影响，算是比较正常，就是不知道为什么会有那么多死细胞，实在是找不出什么原因。
3.我目前正在做hegf表皮细胞生长因子活性检测实验，使用的方法是MTT法，细胞是Balb/c3T3细胞，但是每次做的实验结果都发现，加入生长因子样品和标准品的数值没有维持培养基的高。希望有同样做这个实验的虫友们，给点意见，或者是有机会大家多多交流下，谢谢了。
     MTT实验我已经做了大半年了，中间总是不断有问题出现，现在还是没有能完成，非常着急，有做过类似实验的虫友们，一定要帮帮我呀，非常感谢了！
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努力修炼，等待升级！
1楼2011-07-23 18:40:37
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xiaoxiangtu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+10): 就是因为影响因素太多，所以现在实验结果都不理想，想找做过类似实验的人多交流下 2011-07-25 20:12:53
MTT影响因素太多了，细胞自身生长状态，细胞接种量也很影响结果的。
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6楼2011-07-25 09:12:52
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浪人利利

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+15): 非常感谢，我也有点怀疑是冻存的问题。我的是贴壁细胞，可以把上清去掉，还是谢谢你的回答 2011-07-24 23:54:10
1、不过期最好了，双抗过期不很久也没关系，培养基最好不要用过期的
2、通过你的描述，个人觉得你冻存的细胞可能都有问题（或者中间液氮干掉了，没及时补充）
3、没怎么理解你的意思

个人建议：细胞重新复苏，培养液重新制取，稍微比平时多加一点血清试试；细胞有碎片或者死细胞就及时PBS多洗几次，勤换培养液；虽然你的意思我没完全明白，但是MTT法测定时，96孔板我一般都不把培养液倒掉（防止悬浮细胞倒掉了），直接加MTT、DMSO等处理，然后震荡后直接测定数值；以上仅供参考
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2楼2011-07-23 23:32:10
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lw582482481

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+20): 谢谢你的回答，对我挺有用处的，建议也很好。 2011-07-24 23:56:12
1  双抗过期是没有问题的。低温保存适当的情况下没有差别。培养基过期的话，如果你买的是液体培养基，建议不要用了。如果是固体粉末自己配培养基，没有多大问题。
2  复苏之后死细胞过多，这个是你的细胞状态不好。也许是你在细胞长的过多的时候传代，这样不好（虽然没有养过你这种细胞）。另外就是可能你细胞在消化的时候受损严重，会有部分细胞死亡。而由于你细胞自身长的速度比较快，整体来说不受影响。
3  mtt不知道是啥？但是关于你的EGH的测定我想，这个蛋白是分泌型的，你在测数值的时候是否没有把胞外的那部分没有测定呢？
4  关于你试验的问题，你的对照以及实验组是否完全一致，这个十分重要。二者的细胞密度以及生长条件之类的都很有影响。
    最后，我建议你是在细胞状态调整好之后再做吧。因为细胞死的多，肯定是有问题的。在细胞生长得最旺盛的时候传代但是不能过多或者过少。维持2-6d传一次最好。还有细胞的消化一定要适当。
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30而立
3楼2011-07-24 09:34:26
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aegeansyang

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

luolh2004(金币+10): 我培养的是小鼠胚胎成纤维细胞，是贴壁的细胞，刚复苏的时候死细胞很多，复苏一段时间后死细胞就比较少点，但是还是觉得不正常的，死细胞比较多点 2011-07-24 23:58:09
不知你细胞是接种的时候就出现大量的不贴壁细胞呢，还是培养一段时间后开始出现细胞死亡呢？
如果是前者，可能你的消化过程存在问题；而后者的话可能是培养基有问题了
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4楼2011-07-24 15:05:09
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