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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » puf酶与普通Taq酶混用PCR问题
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

[求助] puf酶与普通Taq酶混用PCR问题

之前用普通Taq酶做的PCR，目的条带比较单一而且很亮，因为要做A/T克隆测序，担心普通Taq酶会导致突变，所以将puf与Taq按1:2混合使用，结果P不出来。请问各位高手，我该作何调整？
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1楼 2011-06-29 10:40:53
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liucong046

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-06-29 19:03:37
mahoumeimei(金币+2): 谢谢 2011-07-01 10:59:16
我没有将两种酶混合液用过，我想这样肯定有问题。takara公司的pfu是平末端的，我给你个建议，你可以试试全式金公司的HIFI酶。是高保真的而且也可以直接用于A/T克隆！！祝你好运！
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微生物分子生物学
2楼2011-06-29 10:47:00
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-06-29 19:03:45
P不出来不好说，但是如果做T/A克隆到话，加Pfu酶不行啊。Pfu酶有3'至5'的外切酶活性（校正功能的来源），会把产物末端的A切掉的，做不了T/A克隆。
T/A克隆接触不多，等高人解答吧
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3楼2011-06-29 10:52:29
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 这个貌似有点险 2011-06-29 19:04:11
引用回帖:
Originally posted by mahoumeimei at 2011-06-29 10:40:53:
之前用普通Taq酶做的PCR，目的条带比较单一而且很亮，因为要做A/T克隆测序，担心普通Taq酶会导致突变，所以将puf与Taq按1:2混合使用，结果P不出来。请问各位高手，我该作何调整？
[eimg]66/e7/1258265_1309315315 ...

用个高保真酶就是了，高保真酶扩增的速度会比普通酶的稍慢点，但是没必要那么急嘛，就让它扩增去好了，混合是可以的，比例哇要你自己去discovery~你设置几个比例试试看哇~应该有扩增出来的，对了，你扩增的片段是不是很长( ⊙o⊙ )哇~
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4楼2011-06-29 10:57:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
1949stone(金币+1): 有需要一般会有公司生产 2011-06-29 19:05:10
引用回帖:
Originally posted by beautybanana at 2011-06-29 10:57:32:
用个高保真酶就是了，高保真酶扩增的速度会比普通酶的稍慢点，但是没必要那么急嘛，就让它扩增去好了，混合是可以的，比例哇要你自己去discovery~你设置几个比例试试看哇~应该有扩增出来的，对了，你扩增的片段 ...

一般高保真酶的proof reading靠的就是5’到3‘外切酶活性，都会把A切掉的。不知道有什么酶保真性高，然后又能留个A做T/A克隆？
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5楼2011-06-29 11:28:37
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hanhaixingyun

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！简单易行啊。 2011-06-29 16:42:54
mahoumeimei(金币+5): 谢谢你的建议 2011-07-01 11:00:33
好像有保真性高还能加A的，具体既不清楚了。
不过你可以用高保真的做，最后72度10min中的时候停止，加入普通taq再运行，应该可以加A
还有就是序列有多大，如果没有超过1K，一般普通taq问题都不打
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6楼2011-06-29 11:42:10
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流。5K以下用Taq不突变有点夸张吧，不知依据何在？ 2011-06-29 16:54:10
mahoumeimei(金币+3): 谢谢建议 2011-07-01 11:01:07
混合用是没问题的，那样用过，也是扩长片段，比例5:1，pfu5。请问楼主扩的片段多长，5K以下直接用普通Taq即可，突变的几率几乎不存在！
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7楼2011-06-29 11:51:28
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-29 16:43:52
或者你可以采取制作T载体的方法，先用pfu扩出目的片段，回收，取出适量加入dATP，72度2小时加A。
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8楼2011-06-29 11:54:20
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-06-29 12:51:27
mahoumeimei(金币+2): 我知道有那种plus的酶，不过实验室刚好有puf和普通Taq，就直接混着用了 2011-07-01 11:04:23
为什么要两者混合呢？
直接买个Taq plus酶不就可以了，taq plus酶是将taq酶和pfu混合得到。。。。
这个酶保真性很高。。。

Taq Plus DNA Polymerase是Taq和pfu DNA Polymerase按照一定
比例混合的酶，具有5'→3'聚合酶活性、双链DNA特异性的5'→3'外切酶
活性和3'→5'外切酶活性。其PCR产物为部分A末端，可直接连接到T/A
克隆载体；或者纯化后加A末端再连接，以提高连接效率。
Taq Plus DNA Polymerase 扩增效率高于单一的Taq DNA
Polymerase或者pfu DNA Polymerase，简单模板可以扩增长达15kb，复
杂模板可达10 kb ； 保真性介于Taq DNA Polymerase 和pfu DNA
Polymerase之间。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
9楼2011-06-29 12:08:04
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pwj

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-06-30 02:57:20
好像有专门的加A的试剂盒的，你找找，好像宝生物就有，我以前用过，对PCR产物加A！
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10楼2011-06-29 20:45:41
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