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汕头大学海洋科学接受调剂
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

[求助] puf酶与普通Taq酶混用PCR问题

之前用普通Taq酶做的PCR,目的条带比较单一而且很亮,因为要做A/T克隆测序,担心普通Taq酶会导致突变,所以将puf与Taq按1:2混合使用,结果P不出来。请问各位高手,我该作何调整?
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 这个貌似有点险 2011-06-29 19:04:11
引用回帖:
Originally posted by mahoumeimei at 2011-06-29 10:40:53:
之前用普通Taq酶做的PCR,目的条带比较单一而且很亮,因为要做A/T克隆测序,担心普通Taq酶会导致突变,所以将puf与Taq按1:2混合使用,结果P不出来。请问各位高手,我该作何调整?
[eimg]66/e7/1258265_1309315315 ...

用个高保真酶就是了,高保真酶扩增的速度会比普通酶的稍慢点,但是没必要那么急嘛,就让它扩增去好了,混合是可以的,比例哇要你自己去discovery~你设置几个比例试试看哇~应该有扩增出来的,对了,你扩增的片段是不是很长( ⊙o⊙ )哇~
4楼2011-06-29 10:57:32
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查看全部 23 个回答

liucong046

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-06-29 19:03:37
mahoumeimei(金币+2): 谢谢 2011-07-01 10:59:16
我没有将两种酶混合液用过,我想这样肯定有问题。takara公司的pfu是平末端的,我给你个建议,你可以试试全式金公司的HIFI酶。是高保真的而且也可以直接用于A/T克隆!!祝你好运!
微生物分子生物学
2楼2011-06-29 10:47:00
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-06-29 19:03:45
P不出来不好说,但是如果做T/A克隆到话,加Pfu酶不行啊。Pfu酶有3'至5'的外切酶活性(校正功能的来源),会把产物末端的A切掉的,做不了T/A克隆。
T/A克隆接触不多,等高人解答吧
3楼2011-06-29 10:52:29
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)


1949stone(金币+1): 有需要一般会有公司生产 2011-06-29 19:05:10
引用回帖:
Originally posted by beautybanana at 2011-06-29 10:57:32:
用个高保真酶就是了,高保真酶扩增的速度会比普通酶的稍慢点,但是没必要那么急嘛,就让它扩增去好了,混合是可以的,比例哇要你自己去discovery~你设置几个比例试试看哇~应该有扩增出来的,对了,你扩增的片段 ...

一般高保真酶的proof reading靠的就是5’到3‘外切酶活性,都会把A切掉的。不知道有什么酶保真性高,然后又能留个A做T/A克隆?
5楼2011-06-29 11:28:37
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