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mamjun

金虫 (小有名气)

[求助] 图例请教聚合酶（Taq酶)外切和内切具体怎么起作用的，急！

有一个茎环状引物，其与模板结合的图形我大致画成这个样子：

（模板）   5’******************************************3‘
                                                                  3’ ******************======)
                                                                                                        5‘======)
                                                                                                    （茎环引物）

说明：引物一部分和模板退火结合，右边的另一部分自己形成茎环结构

我想问得问题是：如果PCR扩增的时候，Taq酶会吧引物5‘端的茎环结构给切掉吗，普通的Taq没有3’到5‘外切活性吧？
那能切除茎环结构的是3’到5‘外切活性，还是5’→3‘外切活性啊？所以说事我搞不明白5’→3’和3‘→5’外切究竟是怎么回事，怎么具体起作用的，谢谢！！

追问：如果不想茎环结构被某种外切活性给切除掉，需要在5‘端添加修饰基团的话，添加什么修饰呢？

[ Last edited by mamjun on 2011-7-21 at 08:21 ]
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1楼2011-07-21 08:18:28
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助。引物合成是可以加保护基团的。 2011-07-21 12:02:48
普通的Taq酶只有3’到5‘外切活性和5’→3的聚合酶活性
3’到5‘外切活性是指从3‘端往5’端一个一个切除核苷酸的活性，所以普通Taq酶不会破坏你的5‘端，
貌似化学合成的引物可以在5’端加保护基团，你咨询一下
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2楼2011-07-21 10:51:17
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-07-21 15:25:30
mamjun(金币+5): 2011-07-23 09:39:57
引用回帖:
Originally posted by anlewo7777 at 2011-07-21 10:51:17:
普通的Taq酶只有3’到5‘外切活性和5’→3的聚合酶活性
3’到5‘外切活性是指从3‘端往5’端一个一个切除核苷酸的活性，所以普通Taq酶不会破坏你的5‘端，
貌似化学合成的引物可以在5’端加保护基团，你咨询一下

普通Taq没有3’到5‘外切活性吧？3‘到5’外切活性是Pfu等高保真酶才有的，是这些酶校正能力的来源。Taq没有，而且扩增后会在3‘端加A，可以用来做TA克隆。Pfu等酶扩增的3’端没有A，因为被酶的3‘到5’外切活性切掉了。
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3楼2011-07-21 12:01:00
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
dhd997: 奖励了，呵呵，你也要申请专家？已经反馈给区长了 2011-07-21 15:25:56
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-21 12:01:00:
普通Taq没有3’到5‘外切活性吧？3‘到5’外切活性是Pfu等高保真酶才有的，是这些酶校正能力的来源。Taq没有，而且扩增后会在3‘端加A，可以用来做TA克隆。Pfu等酶扩增的3’端没有A，因为被酶的3‘到5’外切活 ...

正解，奖励EPI
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2011-07-21 14:26:43
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mamjun

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by anlewo7777 at 2011-07-21 10:51:17:
普通的Taq酶只有3’到5‘外切活性和5’→3的聚合酶活性
3’到5‘外切活性是指从3‘端往5’端一个一个切除核苷酸的活性，所以普通Taq酶不会破坏你的5‘端，
貌似化学合成的引物可以在5’端加保护基团，你咨询一下

我查的资料上说普通Taq酶没有3‘→5’外切活性，只有5‘→3’外切活性呀，高保真Pfu酶倒是都有，普通Taq酶究竟有哪几个呀
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5楼2011-07-21 15:10:01
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 欢迎交流，不要介意哈~ 2011-07-22 12:09:19
mamjun(金币+5): 2011-07-23 18:50:56
不好意思，弄混了，干扰你判断了。
只有有纠错能力（或叫保真能力）的酶才3‘→5’外切活性。
不过需要提醒你的是，你的引物的茎环部分也是会被配对碱基，合成双链的。
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6楼2011-07-21 22:06:19
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mamjun

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by anlewo7777 at 2011-07-21 22:06:19:
不好意思，弄混了，干扰你判断了。
只有有纠错能力（或叫保真能力）的酶才3‘→5’外切活性。
不过需要提醒你的是，你的引物的茎环部分也是会被配对碱基，合成双链的。

你能具体解释下为什么说此茎环部分会被合成双链吗？
是因为变性了、就退火了、就延伸了？还是？。。。。
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7楼2011-07-23 18:58:47
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anlewo7777

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励下 2011-07-23 22:30:18
我的理解是，即使是茎环部分可以自己形成双链，但是，存在一个两种状态的比例（单链状态和茎环状态），单链状态的会配对合成双链没有疑问，但是残余的引物还是有会从茎环状态转变过来成为单链，就像化学平衡一样，另外你的PCR有那么多次循环，留给酶把相当多的引物用掉的时间和机会很多。
如果，你是想获得末端有茎环结构的DNA，你还是想其他的办法
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8楼2011-07-23 21:30:22
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mamjun

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by anlewo7777 at 2011-07-23 21:30:22:
我的理解是，即使是茎环部分可以自己形成双链，但是，存在一个两种状态的比例（单链状态和茎环状态），单链状态的会配对合成双链没有疑问，但是残余的引物还是有会从茎环状态转变过来成为单链，就像化学平衡一样， ...

引物设计高些的Tm值怎样，这样茎环被合成双链的机会是不是就很小了？
还有其他维持茎环结构的方法吗，我只知道再加个保护基团了
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9楼2011-07-24 10:02:55
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mamjun

金虫 (小有名气)
anlewo7777 ( 2011-07-24 15:27:01 ) 引用回复 | 举报广告  
我也没有好办法，提高Tm值似乎没用，

我 ( 2011-07-24 20:16:30 )  
为什么没用呀,Tm值高了，茎环结构不是就不易解链，也不就不容易被合成双链了吗？
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10楼2011-07-24 20:18:02
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