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mamjun

金虫 (小有名气)

[求助] 图例请教聚合酶(Taq酶)外切和内切具体怎么起作用的,急!

有一个茎环状引物,其与模板结合的图形我大致画成这个样子:

(模板)   5’******************************************3‘
                                                                  3’ ******************======)
                                                                                                        5‘======)
                                                                                                    (茎环引物)

说明:引物一部分和模板退火结合,右边的另一部分自己形成茎环结构

我想问得问题是:如果PCR扩增的时候,Taq酶会吧引物5‘端的茎环结构给切掉吗,普通的Taq没有3’到5‘外切活性吧?
那能切除茎环结构的是3’到5‘外切活性,还是5’→3‘外切活性啊?所以说事我搞不明白5’→3’和3‘→5’外切究竟是怎么回事,怎么具体起作用的,谢谢!!

追问:如果不想茎环结构被某种外切活性给切除掉,需要在5‘端添加修饰基团的话,添加什么修饰呢?

[ Last edited by mamjun on 2011-7-21 at 08:21 ]
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mamjun

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by anlewo7777 at 2011-07-23 21:30:22:
我的理解是,即使是茎环部分可以自己形成双链,但是,存在一个两种状态的比例(单链状态和茎环状态),单链状态的会配对合成双链没有疑问,但是残余的引物还是有会从茎环状态转变过来成为单链,就像化学平衡一样, ...

引物设计高些的Tm值怎样,这样茎环被合成双链的机会是不是就很小了?
还有其他维持茎环结构的方法吗,我只知道再加个保护基团了
9楼2011-07-24 10:02:55
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查看全部 12 个回答

anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 鼓励应助。引物合成是可以加保护基团的。 2011-07-21 12:02:48
普通的Taq酶只有3’到5‘外切活性和5’→3的聚合酶活性
3’到5‘外切活性是指从3‘端往5’端一个一个切除核苷酸的活性,所以普通Taq酶不会破坏你的5‘端,
貌似化学合成的引物可以在5’端加保护基团,你咨询一下
2楼2011-07-21 10:51:17
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-07-21 15:25:30
mamjun(金币+5): 2011-07-23 09:39:57
引用回帖:
Originally posted by anlewo7777 at 2011-07-21 10:51:17:
普通的Taq酶只有3’到5‘外切活性和5’→3的聚合酶活性
3’到5‘外切活性是指从3‘端往5’端一个一个切除核苷酸的活性,所以普通Taq酶不会破坏你的5‘端,
貌似化学合成的引物可以在5’端加保护基团,你咨询一下

普通Taq没有3’到5‘外切活性吧?3‘到5’外切活性是Pfu等高保真酶才有的,是这些酶校正能力的来源。Taq没有,而且扩增后会在3‘端加A,可以用来做TA克隆。Pfu等酶扩增的3’端没有A,因为被酶的3‘到5’外切活性切掉了。
3楼2011-07-21 12:01:00
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

dhd997: 奖励了,呵呵,你也要申请专家?已经反馈给区长了 2011-07-21 15:25:56
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-21 12:01:00:
普通Taq没有3’到5‘外切活性吧?3‘到5’外切活性是Pfu等高保真酶才有的,是这些酶校正能力的来源。Taq没有,而且扩增后会在3‘端加A,可以用来做TA克隆。Pfu等酶扩增的3’端没有A,因为被酶的3‘到5’外切活 ...

正解,奖励EPI
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2011-07-21 14:26:43
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