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mamjun

金虫 (小有名气)

[求助] 图例请教聚合酶(Taq酶)外切和内切具体怎么起作用的,急!

有一个茎环状引物,其与模板结合的图形我大致画成这个样子:

(模板)   5’******************************************3‘
                                                                  3’ ******************======)
                                                                                                        5‘======)
                                                                                                    (茎环引物)

说明:引物一部分和模板退火结合,右边的另一部分自己形成茎环结构

我想问得问题是:如果PCR扩增的时候,Taq酶会吧引物5‘端的茎环结构给切掉吗,普通的Taq没有3’到5‘外切活性吧?
那能切除茎环结构的是3’到5‘外切活性,还是5’→3‘外切活性啊?所以说事我搞不明白5’→3’和3‘→5’外切究竟是怎么回事,怎么具体起作用的,谢谢!!

追问:如果不想茎环结构被某种外切活性给切除掉,需要在5‘端添加修饰基团的话,添加什么修饰呢?

[ Last edited by mamjun on 2011-7-21 at 08:21 ]
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 鼓励应助。引物合成是可以加保护基团的。 2011-07-21 12:02:48
普通的Taq酶只有3’到5‘外切活性和5’→3的聚合酶活性
3’到5‘外切活性是指从3‘端往5’端一个一个切除核苷酸的活性,所以普通Taq酶不会破坏你的5‘端,
貌似化学合成的引物可以在5’端加保护基团,你咨询一下
2楼2011-07-21 10:51:17
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 欢迎交流,不要介意哈~ 2011-07-22 12:09:19
mamjun(金币+5): 2011-07-23 18:50:56
不好意思,弄混了,干扰你判断了。
只有有纠错能力(或叫保真能力)的酶才3‘→5’外切活性。
不过需要提醒你的是,你的引物的茎环部分也是会被配对碱基,合成双链的。
6楼2011-07-21 22:06:19
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励下 2011-07-23 22:30:18
我的理解是,即使是茎环部分可以自己形成双链,但是,存在一个两种状态的比例(单链状态和茎环状态),单链状态的会配对合成双链没有疑问,但是残余的引物还是有会从茎环状态转变过来成为单链,就像化学平衡一样,另外你的PCR有那么多次循环,留给酶把相当多的引物用掉的时间和机会很多。
如果,你是想获得末端有茎环结构的DNA,你还是想其他的办法
8楼2011-07-23 21:30:22
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