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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

[求助] 高保真酶PCR

求教：为什么用高保真酶PCR时，经常P不出来？我知道高保真酶的扩增效率比普通Taq要差很多，可是明明前一次能P出来，再做一次就P不出来了。换模板，换引物，换dNTP，但是结果反复不定，我都快要崩溃了。用的是生工的pfu酶，本来想是不是酶的问题，想换宝生物的Ex Taq，结果有师兄用Ex Taq也经常P不出来。我们俩是同样的样品，用的兼并引物。请问有谁遇到过类似的问题吗？
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1楼2011-11-06 22:50:30
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ureyguo

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

mahoumeimei(金币+2): 因为克隆测序。模板、引物的原因都已经排除了。 2011-11-07 08:41:01
你为什么要用高保真得酶，有啥特殊要求吗？没有你就用普通的酶p，extaq还不错的，找找其他的原因比如模板，引物。还有pcr前一次能p出来后一次p不出来很正常啊。做环境微生物的你懂的！
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2楼2011-11-06 23:50:36
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lilyxieyx

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

mahoumeimei(金币+2): 用同一个试剂盒做过两种引物的PCR，都是结果很反复，有时候能出来，有时候出不来。 2011-11-07 08:42:56
先换一对引物p个短一点的片段，排除酶和试剂的问题，如果还是p不出你的片段可能是片段太长或引物和模板不太匹配，需要重新设计引物。
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3楼2011-11-07 03:42:43
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
mahoumeimei(金币+5): 恩，是混合DNA。之前有试过用pfu+Taq混合着用，不过摸不准合适的比例，BSA倒可以试试看。 2011-11-07 10:10:07
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 有经验的虫子哦！ 2011-11-07 16:58:50
用简并引物扩宏基因组DNA（你的模板应该是混合DNA吧）是难度挺大的，我们课题组就专门做这个的，我们大多时候都是用rtaq去扩的，换用高保真酶如PfuUltra® II Fusion HS DNA Polymerase，或NEB的EXtaq都难扩出来的。若要保真度高些，建议你可以用高保真酶再添加rtaq进去混合PCR试试，这样具有一定的效果，要是模板很复杂如有杂质腐殖酸之类的建议添加BSA进去可以提高特异性。
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
4楼2011-11-07 09:59:06
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protein_ex

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 这个是个好问题？可单独发帖提问! 2011-11-08 11:31:24
mahoumeimei(金币+3): 谢谢！那我试着减少模板或加大酶量看看。 2011-11-08 11:37:47
我以前用高保真酶phusion时候偶尔P不出来是模板太多的原因 这种酶不喜欢大量的模板 跟这个有关系吗？
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5楼2011-11-08 10:44:47
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wangzhangwan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2011-11-07 09:59:06
用简并引物扩宏基因组DNA（你的模板应该是混合DNA吧）是难度挺大的，我们课题组就专门做这个的，我们大多时候都是用rtaq去扩的，换用高保真酶如PfuUltra® II Fusion HS DNA Polymerase，或NEB的EXtaq都难扩出来 ...

高保真和Taq酶混合到一起？
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6楼2013-06-17 19:48:36
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
可以在反应体系中加入0.01%的白明胶或Triton X-100,有助于加大反应的特异性。
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7楼2013-06-17 22:21:14
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