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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

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[求助] 高保真酶PCR

求教：为什么用高保真酶PCR时，经常P不出来？我知道高保真酶的扩增效率比普通Taq要差很多，可是明明前一次能P出来，再做一次就P不出来了。换模板，换引物，换dNTP，但是结果反复不定，我都快要崩溃了。用的是生工的pfu酶，本来想是不是酶的问题，想换宝生物的Ex Taq，结果有师兄用Ex Taq也经常P不出来。我们俩是同样的样品，用的兼并引物。请问有谁遇到过类似的问题吗？

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1楼2011-11-06 22:50:30

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lilyxieyx

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【答案】应助回帖

mahoumeimei(金币+2): 用同一个试剂盒做过两种引物的PCR，都是结果很反复，有时候能出来，有时候出不来。 2011-11-07 08:42:56

先换一对引物p个短一点的片段，排除酶和试剂的问题，如果还是p不出你的片段可能是片段太长或引物和模板不太匹配，需要重新设计引物。

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3楼2011-11-07 03:42:43

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ureyguo

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

mahoumeimei(金币+2): 因为克隆测序。模板、引物的原因都已经排除了。 2011-11-07 08:41:01

你为什么要用高保真得酶，有啥特殊要求吗？没有你就用普通的酶p，extaq还不错的，找找其他的原因比如模板，引物。还有pcr前一次能p出来后一次p不出来很正常啊。做环境微生物的你懂的！

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2楼2011-11-06 23:50:36

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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
mahoumeimei(金币+5): 恩，是混合DNA。之前有试过用pfu+Taq混合着用，不过摸不准合适的比例，BSA倒可以试试看。 2011-11-07 10:10:07
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 有经验的虫子哦！ 2011-11-07 16:58:50

用简并引物扩宏基因组DNA（你的模板应该是混合DNA吧）是难度挺大的，我们课题组就专门做这个的，我们大多时候都是用rtaq去扩的，换用高保真酶如PfuUltra® II Fusion HS DNA Polymerase，或NEB的EXtaq都难扩出来的。若要保真度高些，建议你可以用高保真酶再添加rtaq进去混合PCR试试，这样具有一定的效果，要是模板很复杂如有杂质腐殖酸之类的建议添加BSA进去可以提高特异性。

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