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mahoumeimei金虫 (小有名气)
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[求助]
高保真酶PCR
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| 求教：为什么用高保真酶PCR时，经常P不出来？我知道高保真酶的扩增效率比普通Taq要差很多，可是明明前一次能P出来，再做一次就P不出来了。换模板，换引物，换dNTP，但是结果反复不定，我都快要崩溃了。用的是生工的pfu酶，本来想是不是酶的问题，想换宝生物的Ex Taq，结果有师兄用Ex Taq也经常P不出来。我们俩是同样的样品，用的兼并引物。请问有谁遇到过类似的问题吗？ |
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 【分子生物】EPI帖 | 核酸生物学实验经验 |
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lilyxieyx
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3楼2011-11-07 03:42:43
ureyguo
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2楼2011-11-06 23:50:36
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
mahoumeimei(金币+5): 恩，是混合DNA。之前有试过用pfu+Taq混合着用，不过摸不准合适的比例，BSA倒可以试试看。 2011-11-07 10:10:07
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 有经验的虫子哦！ 2011-11-07 16:58:50
mahoumeimei(金币+5): 恩，是混合DNA。之前有试过用pfu+Taq混合着用，不过摸不准合适的比例，BSA倒可以试试看。 2011-11-07 10:10:07
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 有经验的虫子哦！ 2011-11-07 16:58:50
| 用简并引物扩宏基因组DNA（你的模板应该是混合DNA吧）是难度挺大的，我们课题组就专门做这个的，我们大多时候都是用rtaq去扩的，换用高保真酶如PfuUltra® II Fusion HS DNA Polymerase，或NEB的EXtaq都难扩出来的。若要保真度高些，建议你可以用高保真酶再添加rtaq进去混合PCR试试，这样具有一定的效果，要是模板很复杂如有杂质腐殖酸之类的建议添加BSA进去可以提高特异性。 |
4楼2011-11-07 09:59:06
5楼2011-11-08 10:44:47
