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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » puf酶与普通Taq酶混用PCR问题
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

[求助] puf酶与普通Taq酶混用PCR问题

之前用普通Taq酶做的PCR，目的条带比较单一而且很亮，因为要做A/T克隆测序，担心普通Taq酶会导致突变，所以将puf与Taq按1:2混合使用，结果P不出来。请问各位高手，我该作何调整？
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1楼 2011-06-29 10:40:53
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-06-29 19:03:45
P不出来不好说，但是如果做T/A克隆到话，加Pfu酶不行啊。Pfu酶有3'至5'的外切酶活性（校正功能的来源），会把产物末端的A切掉的，做不了T/A克隆。
T/A克隆接触不多，等高人解答吧
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3楼2011-06-29 10:52:29
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
1949stone(金币+1): 有需要一般会有公司生产 2011-06-29 19:05:10
引用回帖:
Originally posted by beautybanana at 2011-06-29 10:57:32:
用个高保真酶就是了，高保真酶扩增的速度会比普通酶的稍慢点，但是没必要那么急嘛，就让它扩增去好了，混合是可以的，比例哇要你自己去discovery~你设置几个比例试试看哇~应该有扩增出来的，对了，你扩增的片段 ...

一般高保真酶的proof reading靠的就是5’到3‘外切酶活性，都会把A切掉的。不知道有什么酶保真性高，然后又能留个A做T/A克隆？
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5楼2011-06-29 11:28:37
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
2428973楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-04 15:57:30
这个情况应该是和比例有关吧，生工的Taq plus 就是Taq里加了pfu的，同时具有高保真和末端加A的功能。...

谢谢指教啦~
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23楼2012-08-04 17:18:05
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