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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » puf酶与普通Taq酶混用PCR问题
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yguang

木虫 (职业作家)
★ ★
西瓜(金币+2): 经验很丰富呢！厉害！ 2011-06-30 02:58:14
引用回帖:
Originally posted by yguang at 2011-06-29 11:51:28:
混合用是没问题的，那样用过，也是扩长片段，比例5:1，pfu5。请问楼主扩的片段多长，5K以下直接用普通Taq即可，突变的几率几乎不存在！

5k以下用普通Taq扩，这个可以参考Taq的说明书，本人也做过的，TaKaRa的rTaq和田根普通Taq都用过，也用其他公司的，只要能扩出来的好像还没出过错的。
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11楼2011-06-29 21:18:09
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love_st

金虫 (著名写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-30 02:58:20
你的pfu量太多，秘诀是1：25
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12楼2011-06-29 21:30:29
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-30 02:58:45
buffer一样吗？再说哪有这么麻烦，现在平末端的载体这么多，都有TOP系列了，5分钟转化的，感觉不比TA效率低，好用的很。
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生命不息，探索不止。
13楼2011-06-29 22:22:02
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hanhaixingyun at 2011-06-29 11:42:10:
好像有保真性高还能加A的，具体既不清楚了。
不过你可以用高保真的做，最后72度10min中的时候停止，加入普通taq再运行，应该可以加A
还有就是序列有多大，如果没有超过1K，一般普通taq问题都不打

是的，就是楼下所说的Taq plus酶，但是实验室刚好有puf 以及普通Taq，所以就直接混用了。我的扩增片段是700多bp，因为拿到序列后，准备做蛋白表达的，所以才想尽量做到高保真。谢谢你的建议，我会试试看的
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14楼2011-07-01 10:36:06
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libin051mail

铜虫 (初入文坛)
我用的TAKARA EX Taq，感觉还行
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15楼2011-07-13 11:16:21
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roomofxw

木虫 (正式写手)


Pfu和Taq混着用，不就是taq plus么……
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16楼2011-07-13 11:41:52
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zgb1982

木虫 (正式写手)
可以混用，我们一起这么用，没什么大问题啊
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17楼2011-07-14 11:13:52
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右手画情916

新虫 (初入文坛)
本人用的是10乘的PFU，一般和水1比4的稀释，再加入1|10的dntp，扩4K的没问题的！
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18楼2012-08-01 21:20:27
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30937747

木虫 (小有名气)
引用回帖:
1736985楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-06-29 11:28:37
一般高保真酶的proof reading靠的就是5’到3‘外切酶活性，都会把A切掉的。不知道有什么酶保真性高，然后又能留个A做T/A克隆？...

好像Takara的 LA taq和Ex taq都可以
但是Ex 只能保证2KB以内
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我依旧会努力.
19楼2012-08-03 20:43:07
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30937747

木虫 (小有名气)
引用回帖:
1757413楼: Originally posted by pwj at 2011-06-29 20:45:41
好像有专门的加A的试剂盒的，你找找，好像宝生物就有，我以前用过，对PCR产物加A！

加A尾何必用试剂盒啊。。真是奢侈。。。直接加dNTP，普通taq酶就可以了。
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我依旧会努力.
20楼2012-08-03 20:44:16
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