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yguang

木虫 (职业作家)

★ ★
西瓜(金币+2): 经验很丰富呢!厉害! 2011-06-30 02:58:14
引用回帖:
Originally posted by yguang at 2011-06-29 11:51:28:
混合用是没问题的,那样用过,也是扩长片段,比例5:1,pfu5。请问楼主扩的片段多长,5K以下直接用普通Taq即可,突变的几率几乎不存在!

5k以下用普通Taq扩,这个可以参考Taq的说明书,本人也做过的,TaKaRa的rTaq和田根普通Taq都用过,也用其他公司的,只要能扩出来的好像还没出过错的。
11楼2011-06-29 21:18:09
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love_st

金虫 (著名写手)


★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-30 02:58:20
你的pfu量太多,秘诀是1:25
12楼2011-06-29 21:30:29
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-30 02:58:45
buffer一样吗?再说哪有这么麻烦,现在平末端的载体这么多,都有TOP系列了,5分钟转化的,感觉不比TA效率低,好用的很。
生命不息,探索不止。
13楼2011-06-29 22:22:02
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by hanhaixingyun at 2011-06-29 11:42:10:
好像有保真性高还能加A的,具体既不清楚了。
不过你可以用高保真的做,最后72度10min中的时候停止,加入普通taq再运行,应该可以加A
还有就是序列有多大,如果没有超过1K,一般普通taq问题都不打

是的,就是楼下所说的Taq plus酶,但是实验室刚好有puf 以及普通Taq,所以就直接混用了。我的扩增片段是700多bp,因为拿到序列后,准备做蛋白表达的,所以才想尽量做到高保真。谢谢你的建议,我会试试看的
14楼2011-07-01 10:36:06
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libin051mail

铜虫 (初入文坛)

我用的TAKARA EX Taq,感觉还行
15楼2011-07-13 11:16:21
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roomofxw

木虫 (正式写手)



Pfu和Taq混着用,不就是taq plus么……
16楼2011-07-13 11:41:52
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zgb1982

木虫 (正式写手)

可以混用,我们一起这么用,没什么大问题啊
17楼2011-07-14 11:13:52
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右手画情916

新虫 (初入文坛)

本人用的是10乘的PFU,一般和水1比4的稀释,再加入1|10的dntp,扩4K的没问题的!
18楼2012-08-01 21:20:27
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30937747

木虫 (小有名气)

引用回帖:
1736985楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-06-29 11:28:37
一般高保真酶的proof reading靠的就是5’到3‘外切酶活性,都会把A切掉的。不知道有什么酶保真性高,然后又能留个A做T/A克隆?...

好像Takara的 LA taq和Ex taq都可以
但是Ex 只能保证2KB以内
我依旧会努力.
19楼2012-08-03 20:43:07
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30937747

木虫 (小有名气)

引用回帖:
1757413楼: Originally posted by pwj at 2011-06-29 20:45:41
好像有专门的加A的试剂盒的,你找找,好像宝生物就有,我以前用过,对PCR产物加A!

加A尾何必用试剂盒啊。。真是奢侈。。。直接加dNTP,普通taq酶就可以了。
我依旧会努力.
20楼2012-08-03 20:44:16
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