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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

[求助] puf酶与普通Taq酶混用PCR问题

之前用普通Taq酶做的PCR，目的条带比较单一而且很亮，因为要做A/T克隆测序，担心普通Taq酶会导致突变，所以将puf与Taq按1:2混合使用，结果P不出来。请问各位高手，我该作何调整？
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1楼 2011-06-29 10:40:53
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流。5K以下用Taq不突变有点夸张吧，不知依据何在？ 2011-06-29 16:54:10
mahoumeimei(金币+3): 谢谢建议 2011-07-01 11:01:07
混合用是没问题的，那样用过，也是扩长片段，比例5:1，pfu5。请问楼主扩的片段多长，5K以下直接用普通Taq即可，突变的几率几乎不存在！
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7楼2011-06-29 11:51:28
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liucong046

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-06-29 19:03:37
mahoumeimei(金币+2): 谢谢 2011-07-01 10:59:16
我没有将两种酶混合液用过，我想这样肯定有问题。takara公司的pfu是平末端的，我给你个建议，你可以试试全式金公司的HIFI酶。是高保真的而且也可以直接用于A/T克隆！！祝你好运！
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微生物分子生物学
2楼2011-06-29 10:47:00
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-06-29 19:03:45
P不出来不好说，但是如果做T/A克隆到话，加Pfu酶不行啊。Pfu酶有3'至5'的外切酶活性（校正功能的来源），会把产物末端的A切掉的，做不了T/A克隆。
T/A克隆接触不多，等高人解答吧
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3楼2011-06-29 10:52:29
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 这个貌似有点险 2011-06-29 19:04:11
引用回帖:
Originally posted by mahoumeimei at 2011-06-29 10:40:53:
之前用普通Taq酶做的PCR，目的条带比较单一而且很亮，因为要做A/T克隆测序，担心普通Taq酶会导致突变，所以将puf与Taq按1:2混合使用，结果P不出来。请问各位高手，我该作何调整？
[eimg]66/e7/1258265_1309315315 ...

用个高保真酶就是了，高保真酶扩增的速度会比普通酶的稍慢点，但是没必要那么急嘛，就让它扩增去好了，混合是可以的，比例哇要你自己去discovery~你设置几个比例试试看哇~应该有扩增出来的，对了，你扩增的片段是不是很长( ⊙o⊙ )哇~
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4楼2011-06-29 10:57:32
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