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swallow52u

银虫 (正式写手)

[求助] PCR的电泳结果是除了Marker能出来条带，其他都是什么都没有

我是做的RT-PCR做的细胞的，在提取完RNA后我做了电泳和浓度测定，结果都还不错。也顺利的反转录成了CDNA，在做β-actin的PCR时，结果很好，条带也比较清楚。我还做了两遍，先是做了正常对照组的，接着跑了所有样本的β-actin，所有样都出来了，但我现在已经重复不出来了，条件设置的都一样！我也思考了下原因，可能是CDNA降解了？或者是引物污染了？我只能想到这么多啊？请各位高手帮帮我啊，我的实验该怎样改进？谢谢了？现在的PCR的电泳结果是除了Marker能出来条带，其他都是什么都没有。愁死我了啊！
我的PCR体系是
PCR步骤: 20ul体系
MIX        10uL
cDNA        1 uL        
引物上游        1 uL，        
引物下游        1 uL
DEPC H2O        补足20ul        
加样的顺序也是这样的，不知道合适不？
PCR上机设置温度:
处理        温度        时间
预变性        94℃        5min
变性        94℃        30s
退火        根据说明上下浮动2℃        45s
延伸        72℃        30s
循环        35 从第2个开始        45s/个
延伸        72        7min
        4℃        Forever

[ Last edited by 1949stone on 2011-5-20 at 17:59 ]
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我要我的幸福,谁也夺不走!
1楼 2011-05-20 01:36:12
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swallow52u

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-20 08:29:27
dhd997(EPI-1): 暂时撤回。确实有用在补加 2011-05-20 11:03:08
我的PCR体系是
PCR步骤: 20ul体系
MIX        10uL
cDNA        1 uL        
引物上游        1 uL，        
引物下游        1 uL
DEPC H2O        补足20ul        
加样的顺序也是这样的，不知道合适不？
PCR上机设置温度:
处理        温度        时间
预变性        94℃        5min
变性        94℃        30s
退火        根据说明上下浮动2℃        45s
延伸        72℃        30s
循环        35 从第2个开始        45s/个
延伸        72        7min
        4℃        Forever
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我要我的幸福,谁也夺不走!
2楼2011-05-20 01:55:39
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七
★ ★
dhd997(金币+2): 可能是我粗心，您是否有更好的见解？ 2011-05-20 11:03:43
这个加分和EPI给的很莫名其妙啊  不知道版主怎么给的
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与人玫瑰手有余香
3楼2011-05-20 10:04:07
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
dhd997: 可能是我粗心，您是否有更好的见解？ 2011-05-20 11:03:53
引用回帖:
Originally posted by swallow52u at 2011-05-20 01:55:39:
我的PCR体系是
PCR步骤: 20ul体系
MIX        10uL
cDNA        1 uL        
引物上游        1 uL，        
引物下游        1 uL
DEPC H2O        补足20ul        
加样的顺序也是这样的，不知道合适 ...

这样也给金币和EPI，版版粗心了吧？
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
4楼2011-05-20 10:08:54
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
1949stone: 也不要伤害大家的积极性啊 2011-05-20 17:58:28
不知道2楼给出的程度和体系是否能够帮助楼主解决问题呢？如果能，那么理应给EPI；可是楼主还没有尝试，所以。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-05-20 10:52:45
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七
★
1949stone(金币+1): 刚刚发现啊 2011-05-20 17:59:37
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-20 10:52:45:
不知道2楼给出的程度和体系是否能够帮助楼主解决问题呢？如果能，那么理应给EPI；可是楼主还没有尝试，所以。。。

你不觉得二楼就是楼主吗
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与人玫瑰手有余香
6楼2011-05-20 15:42:54
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by 路人甲007 at 2011-05-20 15:42:54:
你不觉得二楼就是楼主吗

额。。。我刚反应过来，关键是被版主的EPI给误导了，我还以为2楼的童鞋只是给出他的反应程序呢。。。

ps:做实验太累了，都有点晕了。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2011-05-20 15:51:40
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-20 15:51:40:
额。。。我刚反应过来，关键是被版主的EPI给误导了，我还以为2楼的童鞋只是给出他的反应程序呢。。。

ps:做实验太累了，都有点晕了。

貌似版主现在也还没有反应过来呢
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与人玫瑰手有余香
8楼2011-05-20 16:07:53
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
1949stone: 原来如此 哈哈 2011-05-20 17:59:19
引用回帖:
Originally posted by 路人甲007 at 2011-05-20 16:07:53:
貌似版主现在也还没有反应过来呢

版主做实验也比较累，还要管理板块，很不容易滴。。。体谅体谅撒。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
9楼2011-05-20 16:22:21
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tongyanna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

swallow52u(金币+1): 2011-05-21 00:38:35
swallow52u(金币+1): 2011-05-22 10:42:11
swallow52u(金币+1): 2011-05-24 15:32:05
MIX每次用的时候要混匀；加样后也要混匀；模版降解是个问题，每次吸取模板时稍微吹打下；引物方面降解可能性稍小点；每次加样可以放冰上，尝试下！反应体系只要你以前出来过，应该问题不大，模版可以考虑重做，引物若有降解，在电泳时能看出来的啊！
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自己的路，自己快乐的走
10楼2011-05-20 18:03:34
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