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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】转化后的大肠杆菌复苏的转速有影响吗?
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】转化后的大肠杆菌复苏的转速有影响吗?

1.通常大肠杆菌DH5a热转化以后，都要加入少量的不加抗生素的LB在37℃下复苏，各位平时复苏的条件是什么呢？多少转多长时间呢？

2.大肠表达宿主菌BL21(DE3)热转化，是42℃，多长时间呢？常规是90S,但是pET表达手册上是45S，各位平时的经验呢？复苏的条件是什么呢？多少转多长时间呢？
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1楼 2011-04-12 19:15:21
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
xiaoyu1014126(金币+1): 2011-04-13 20:27:29
dhd997(金币+3): good 2011-04-15 09:24:05
引用回帖:
Originally posted by xiaoyu1014126 at 2011-04-12 19:15:21:
1.通常大肠杆菌DH5a热转化以后，都要加入少量的不加抗生素的LB在37℃下复苏，各位平时复苏的条件是什么呢？多少转多长时间呢？

2.大肠表达宿主菌BL21(DE3)热转化，是42℃，多长时间呢？常规是90S,但是pET表达手 ...

1.以转化100ulDH5a感受态细胞为例，转化完成后加入800ul的LB培养基37℃ 220r/min震荡培养1h后就可以涂板。先5000r/min离心5min倒掉大部分上清，剩下的菌体（约80ul）用移液器混匀后均匀涂布在事先预热的平板上。
2.热激时间的确定与装感受态所用的离心管厚度有关系，所以你会看到不同的说明书上介绍的热激时间不一样，你可以自己做个梯度试一下，一般来讲30-90s之间都是可以的，当然转化率有些许的差异
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4楼2011-04-13 16:51:53
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 22:09:03
xiaoyu1014126(金币+1): 2011-04-12 22:27:05
引用回帖:
Originally posted by xiaoyu1014126 at 2011-04-12 19:15:21:
1.通常大肠杆菌DH5a热转化以后，都要加入少量的不加抗生素的LB在37℃下复苏，各位平时复苏的条件是什么呢？多少转多长时间呢？

2.大肠表达宿主菌BL21(DE3)热转化，是42℃，多长时间呢？常规是90S,但是pET表达手 ...

1、直接放37度水浴中，不转，这时候细胞非常脆弱，半小时候拿到150r/min摇床。
2、我们就用90秒的，复苏条件同1。
效果还不错，其他小组也有用不同的方法。
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2楼2011-04-12 19:28:08
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郝钊

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 22:09:08
xiaoyu1014126(金币+1): 2011-04-12 22:27:07
复苏的时候不是在1.5离心管里吗？摇床基本上起不到作用，放在水浴锅或者培养箱就可以了。关关于热激时间，这个更是没有一个标准，从45s到120s的都有，这个影响不是太大，关键还是要看你的感受态细胞感受效率和连接液或质粒的质量。有一个师妹在忘记热激的情况下，转化子长了一平板，验证后都是阳性克隆。
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3楼2011-04-12 20:19:07
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logicthief

新虫 (初入文坛)
其实不复苏，直接涂板也没问题，我们实验室一直这么做。用的是TIANGEN的感受态。
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6楼2011-04-14 21:11:40
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6020596255楼
2011-04-14 19:43   回复  
引用回帖:
Originally posted by 郝钊 at 2011-04-12 20:19:07: 复苏的时候不是在1.5离心管里吗？摇床基本上起不到作用，放在水浴锅或者培养箱就可以了。关关于热激时间，这个更是没有一个标准，从45s到120s的都有，这个影响不是太大，关键还是要看你的感受态细胞感受效率和连接 ...

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