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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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runze116

铁虫 (初入文坛)


[交流] 【求助/交流】连接转化-好难

最近做一个载体的构建,最后一个片段连接,做了不下10次了,依然没有结果。
现在严重怀疑自己的实验技能和人品。
请大家帮忙。
我的载体和DNA片段酶切位点为SacII和NotI,不知道是不是这两个酶有什么不同?
或者胶回收试剂盒的问题?
或者连接酶的问题?
再或者感受态细胞的问题?
现在搞得我对什么都怀疑,但是以前都用这套体系是可以出来的。
好纠结... ...

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hzkui602

新虫 (初入文坛)


如果怀疑这些东西,那就一步步检测吗!
2楼2011-02-26 12:54:32
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★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-02-26 13:35:30
runze116(金币+1): 2011-03-01 08:11:22
每一步都将对照做好了,一步步排除。

比如实验室其他人最近做成功过,那么证明感受态是没有问题的。

如果人家也是用的你的那两个酶,那证明酶也是没有问题的。

换个人帮你做一次。。。。。。

有的时候还真可能是RP问题,,开玩笑的,每个人的操作可能有差异罢了。
3楼2011-02-26 13:01:09
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lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-26 13:35:40
能把你连接转化的实验方法发上来吗?大家一起看看有什么问题
涉及的酶要把厂家写上来
4楼2011-02-26 13:12:19
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602059625

金虫 (知名作家)


上面两位专家,人家只是抱怨一下,不用这么认真
5楼2011-02-26 13:55:55
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wangyeliu

木虫 (著名写手)


注意细节和关键步骤
6楼2011-02-26 14:15:43
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★ ★
lstt09nk(金币+2): 热心虫友,欢迎多多交流~~ 2011-02-28 09:36:19
runze116(金币+1): 2011-03-01 08:11:12
连接一般情况比较好做!
1:感受态细胞要好,效率要高,即便你的重组载体构建好了,细胞不好,依然不会有结果!
2:连接的时候DNA片段和质粒的比例要适当,一般DNA多一些;
3:连接时间稍微长一些,当然了假阳性会有,但是我觉得吧 时间长一些对于不太好连的DNA片段好一些!、
7楼2011-02-26 14:16:33
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)


runze116(金币+1): 2011-03-01 08:11:51
你说的没有结果,是指什么结果?连接不成功还是连接后鉴定不对?还是什么其他的……………………
8楼2011-02-26 16:15:43
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)



lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-28 09:36:37
runze116(金币+5): 2011-03-01 08:11:00
有人说连接放在4℃,连接时间为48h会提高连接效率;
感受态细胞转化效率通过某特定质粒来计算;
然后再积累RP;
静等结果出现
9楼2011-02-26 22:46:52
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zhouxj

至尊木虫 (文坛精英)


经验,请教成功的
10楼2011-02-27 23:42:44
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power103

银虫 (初入文坛)


★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 鼓励新虫交流~ 2011-02-28 09:37:03
runze116(金币+1): 用的就是NEB的酶 2011-03-01 08:12:16
可能酶切体系不对,你好好查查酶公司protocol。建议你用NEB的酶。
如果还不行的话,把转化量加大,不要离心了直接涂板子。
11楼2011-02-28 00:10:04
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翱宇

禁虫 (正式写手)


runze116(金币+1): 谢谢提醒 2011-03-01 08:12:38
建议先将片段和载体跑胶看是否回收出来了呢,选择连接加入载体和片段后,再加水,放到65度温育10分钟,中间弹几次,将粘性末端自身的搭配打开,放入冰上2分钟,再加入酶的buffer,和连接酶,转化时选择购买的感受态细胞。
12楼2011-02-28 13:06:51
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power103

银虫 (初入文坛)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果你确定protocol不错的话,可以用另一个带有你用的那两个酶的酶切位点的质粒做一下对照,如果能切下来,说明你的质粒用问题,建议你测一下序去。
13楼2011-03-02 23:25:01
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rhjilio

新虫 (小有名气)


我也是,怎么办
14楼2018-03-27 14:46:37
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一米吃苹果

新虫 (小有名气)


换个人帮你做
15楼2018-03-27 15:41:35
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