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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接转化-好难
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runze116

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】连接转化-好难

最近做一个载体的构建，最后一个片段连接，做了不下10次了，依然没有结果。
现在严重怀疑自己的实验技能和人品。
请大家帮忙。
我的载体和DNA片段酶切位点为SacII和NotI，不知道是不是这两个酶有什么不同？
或者胶回收试剂盒的问题？
或者连接酶的问题？
再或者感受态细胞的问题?
现在搞得我对什么都怀疑，但是以前都用这套体系是可以出来的。
好纠结... ...
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1楼 2011-02-26 12:45:40
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 热心虫友，欢迎多多交流~~ 2011-02-28 09:36:19
runze116(金币+1): 2011-03-01 08:11:12
连接一般情况比较好做！
1：感受态细胞要好，效率要高，即便你的重组载体构建好了，细胞不好，依然不会有结果！
2：连接的时候DNA片段和质粒的比例要适当，一般DNA多一些；
3：连接时间稍微长一些，当然了假阳性会有，但是我觉得吧 时间长一些对于不太好连的DNA片段好一些！、
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7楼2011-02-26 14:16:33
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hzkui602

新虫 (初入文坛)
如果怀疑这些东西，那就一步步检测吗！
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2楼2011-02-26 12:54:32
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-02-26 13:35:30
runze116(金币+1): 2011-03-01 08:11:22
每一步都将对照做好了，一步步排除。

比如实验室其他人最近做成功过，那么证明感受态是没有问题的。

如果人家也是用的你的那两个酶，那证明酶也是没有问题的。

换个人帮你做一次。。。。。。

有的时候还真可能是RP问题，，开玩笑的，每个人的操作可能有差异罢了。
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3楼2011-02-26 13:01:09
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-26 13:35:40
能把你连接转化的实验方法发上来吗？大家一起看看有什么问题
涉及的酶要把厂家写上来
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4楼2011-02-26 13:12:19
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