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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接转化-好难
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runze116

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】连接转化-好难

最近做一个载体的构建，最后一个片段连接，做了不下10次了，依然没有结果。
现在严重怀疑自己的实验技能和人品。
请大家帮忙。
我的载体和DNA片段酶切位点为SacII和NotI，不知道是不是这两个酶有什么不同？
或者胶回收试剂盒的问题？
或者连接酶的问题？
再或者感受态细胞的问题?
现在搞得我对什么都怀疑，但是以前都用这套体系是可以出来的。
好纠结... ...
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1楼2011-02-26 12:45:40
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hzkui602

新虫 (初入文坛)
如果怀疑这些东西，那就一步步检测吗！
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2楼2011-02-26 12:54:32
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-02-26 13:35:30
runze116(金币+1): 2011-03-01 08:11:22
每一步都将对照做好了，一步步排除。

比如实验室其他人最近做成功过，那么证明感受态是没有问题的。

如果人家也是用的你的那两个酶，那证明酶也是没有问题的。

换个人帮你做一次。。。。。。

有的时候还真可能是RP问题，，开玩笑的，每个人的操作可能有差异罢了。
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3楼2011-02-26 13:01:09
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-26 13:35:40
能把你连接转化的实验方法发上来吗？大家一起看看有什么问题
涉及的酶要把厂家写上来
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4楼2011-02-26 13:12:19
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602059625

金虫 (知名作家)
上面两位专家，人家只是抱怨一下，不用这么认真
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5楼2011-02-26 13:55:55
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wangyeliu

木虫 (著名写手)
注意细节和关键步骤
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6楼2011-02-26 14:15:43
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 热心虫友，欢迎多多交流~~ 2011-02-28 09:36:19
runze116(金币+1): 2011-03-01 08:11:12
连接一般情况比较好做！
1：感受态细胞要好，效率要高，即便你的重组载体构建好了，细胞不好，依然不会有结果！
2：连接的时候DNA片段和质粒的比例要适当，一般DNA多一些；
3：连接时间稍微长一些，当然了假阳性会有，但是我觉得吧 时间长一些对于不太好连的DNA片段好一些！、
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7楼2011-02-26 14:16:33
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
runze116(金币+1): 2011-03-01 08:11:51
你说的没有结果，是指什么结果？连接不成功还是连接后鉴定不对？还是什么其他的……………………
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8楼2011-02-26 16:15:43
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-28 09:36:37
runze116(金币+5): 2011-03-01 08:11:00
有人说连接放在4℃，连接时间为48h会提高连接效率；
感受态细胞转化效率通过某特定质粒来计算；
然后再积累RP；
静等结果出现
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9楼2011-02-26 22:46:52
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zhouxj

至尊木虫 (文坛精英)
经验，请教成功的
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10楼2011-02-27 23:42:44
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power103

银虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 鼓励新虫交流~ 2011-02-28 09:37:03
runze116(金币+1): 用的就是NEB的酶 2011-03-01 08:12:16
可能酶切体系不对，你好好查查酶公司protocol。建议你用NEB的酶。
如果还不行的话，把转化量加大，不要离心了直接涂板子。
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11楼2011-02-28 00:10:04
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翱宇

禁虫 (正式写手)
runze116(金币+1): 谢谢提醒 2011-03-01 08:12:38
建议先将片段和载体跑胶看是否回收出来了呢，选择连接加入载体和片段后，再加水，放到65度温育10分钟，中间弹几次，将粘性末端自身的搭配打开，放入冰上2分钟，再加入酶的buffer，和连接酶，转化时选择购买的感受态细胞。
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12楼2011-02-28 13:06:51
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power103

银虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果你确定protocol不错的话，可以用另一个带有你用的那两个酶的酶切位点的质粒做一下对照，如果能切下来，说明你的质粒用问题，建议你测一下序去。
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13楼2011-03-02 23:25:01
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rhjilio

新虫 (小有名气)
我也是，怎么办
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14楼2018-03-27 14:46:37
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一米吃苹果

新虫 (小有名气)
换个人帮你做
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15楼2018-03-27 15:41:35
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