版块导航: 正在加载中...

登录注册

应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜

返回列表

【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 glannee 的 86 个金币，回帖就立即获得 1 个金币，每人有 1 次机会

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

glannee

铁杆木虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 16527.2
帖子: 550
在线: 521.5小时
虫号: 316587

[交流] 【求助/交流】急！酿酒酵母破壁及SDS-PAGE电泳问题

本人实验的宿主菌是一株工厂中正在使用的工业酿酒酵母。

前期是构建载体、连接启动子和目的基因等工作，不再赘述。现在将目的基因整合入酿酒酵母染色体，提取20个转化子基因组DNA进行PCR，可以P出目的基因条带（原始菌未P出）。但是这些转化子并不表达目的基因的特性（利用木糖产酒精）。由于这些基因表达产物为胞内酶，所以想通过细胞破壁、蛋白电泳直观检测目的基因是否表达。

SDS-PAGE蛋白电泳时，分别以2个基因工程菌做阳性对照、以这个原始宿主菌作阴性对照，试过不同的上样量（最大达到60μL），考马斯亮蓝染色，但是跑出的条带都很淡很淡，无法作出比较和判断。
跑蛋白电泳前，使用过超声、玻璃珠涡旋、反复冻融（液氮--65℃水浴）等方法进行酵母菌破壁，但显微镜观察，只有30%左右原生质体；也是用过蜗牛酶，破壁率在50%左右。

实验室其他同学的蛋白电泳都是检测胞外酶，直接用发酵液上清上样即可，跑出的条带清晰、美观。查资料试过一些方法，但都无效。请教各位做过酿酒酵母的老师同学，这个蛋白电泳的问题是不是出在细胞破碎上？针对酿酒酵母细胞，有什么好的破碎/破壁方法，同时不影响蛋白质和DNA的后续检测？还有什么注意事项？

现在急需这个蛋白电泳的结果验证我前期实验。恳请大家帮助！

[ Last edited by glannee on 2010-11-13 at 23:21 ]

回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

酿酒酵母破胞问题求助已经有21人回复
酿酒酵母基因敲除遇到了问题，求高手指点！已经有13人回复
怎么确定酵母破壁成功呢？谢谢已经有4人回复
胞外蛋白跑SDS-PAGE电泳已经有7人回复
关于SDS-PAGE电泳的问题已经有5人回复
酿酒酵母转化问题已经有15人回复
待电转的酿酒酵母多少OD合适？已经有5人回复
求教一个关于SDS-PAGE电泳的问题（电泳条带的重影以及marker最后一条带跑不出来）已经有5人回复
酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间已经有22人回复
求教高手SDS-PAGE电泳已经有10人回复
SDS蛋白电泳问题已经有11人回复
求助一个关于酿酒酵母转化的问题已经有19人回复
请教为啥SDS-PAGE电泳条带弥散？已经有10人回复
关于SDS-PAGE电泳问题已经有12人回复
SDS-PAGE蛋白电泳已经有23人回复
酿酒酵母转化建立突变库已经有13人回复
SDS-PAGE电泳遇到的问题已经有26人回复
SDS-PAGE电泳溴酚蓝前沿线和样品带在一条线上是什么原因啊。已经有14人回复
SDS-PAGE蛋白电泳条带问题已经有7人回复
SDS-PAGE电泳，为什么溴酚蓝的前沿线总跑不平啊。。。已经有13人回复
【求助】急！有木有做过Tricine－SDS－PAGE小分子蛋白电泳的进！已经有32人回复
【求助】SDS-PAGE电泳上样量已经有6人回复
【求助/交流】SDS-PAGE电泳问题已经有38人回复
【求助/交流】SDS-PAGE电泳跑的特别慢已经有23人回复
【求助/交流】酵母菌破壁已经有16人回复
【求助/交流】酿酒酵母利用半乳糖的问题已经有13人回复
【求助/交流】玻璃珠破碎细胞已经有17人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:
查看全部散金贴

1楼2010-11-13 22:56:25

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

dispy

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 725.1
帖子: 128
在线: 62.9小时
虫号: 1139120

★
glannee(金币+1):谢谢参与

用液氮试试