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[交流]
【求助/交流】急！酿酒酵母破壁及SDS-PAGE电泳问题
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本人实验的宿主菌是一株工厂中正在使用的工业酿酒酵母。 前期是构建载体、连接启动子和目的基因等工作，不再赘述。现在将目的基因整合入酿酒酵母染色体，提取20个转化子基因组DNA进行PCR，可以P出目的基因条带（原始菌未P出）。但是这些转化子并不表达目的基因的特性（利用木糖产酒精）。由于这些基因表达产物为胞内酶，所以想通过细胞破壁、蛋白电泳直观检测目的基因是否表达。 SDS-PAGE蛋白电泳时，分别以2个基因工程菌做阳性对照、以这个原始宿主菌作阴性对照，试过不同的上样量（最大达到60μL），考马斯亮蓝染色，但是跑出的条带都很淡很淡，无法作出比较和判断。 跑蛋白电泳前，使用过超声、玻璃珠涡旋、反复冻融（液氮--65℃水浴）等方法进行酵母菌破壁，但显微镜观察，只有30%左右原生质体；也是用过蜗牛酶，破壁率在50%左右。 实验室其他同学的蛋白电泳都是检测胞外酶，直接用发酵液上清上样即可，跑出的条带清晰、美观。查资料试过一些方法，但都无效。请教各位做过酿酒酵母的老师同学，这个蛋白电泳的问题是不是出在细胞破碎上？针对酿酒酵母细胞，有什么好的破碎/破壁方法，同时不影响蛋白质和DNA的后续检测？还有什么注意事项？ 现在急需这个蛋白电泳的结果验证我前期实验。恳请大家帮助！ [ Last edited by glannee on 2010-11-13 at 23:21 ] |
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dhd997(金币+1):鼓励回帖交流。 2010-11-14 08:41:56
dhd997(金币+1):鼓励回帖交流。 2010-11-14 08:41:56
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谢谢，就液氮研磨没试过，我这两天试试用石英砂砂漩涡再跑。 我用的是组成型的强启动子，整合后目的基因拷贝数应该在100左右，如果表达，表达量应该不会太低。而且转化子在木糖筛选平板上能生长，就是不利用木糖发酵酒精。 问题是，如果只是目的基因跑PAGE很难看到目的条带，那阳性对照和阴性对照中，正常表达的原有基因，也应该有清晰的条带出来的吧？而结果是每条泳道中条带很淡，无法做任何比较。所以现在分析不出问题出在哪里 [ Last edited by glannee on 2010-11-13 at 23:34 ] |
3楼2010-11-13 23:26:35
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glannee(金币+1): 谢谢参与
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13楼2014-04-26 16:38:39
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15楼2014-11-24 09:41:08
