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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接产物，是否可以直接做PCR模板？
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dqvictory

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接产物，是否可以直接做PCR模板？ 已有10人参与

请教各位大侠：
    T4酶要不要先灭活其中的T4连接酶？Buffer中的离子对PCR反应有影响吗？如果需要的话，要怎样进行纯化呢？
    谢谢啦！
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把记忆随身携带！
1楼 2010-10-27 11:56:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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连接产物为什么要直接做PCR呢…………我倒是好奇这个问题
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2楼2010-10-27 12:42:17
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-10-27 12:42:17:
连接产物为什么要直接做PCR呢…………我倒是好奇这个问题

估计是想看看有没有连上的，要是没连上就不做转化了，毕竟转化比较费时间，哈哈
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3楼2010-10-27 12:48:30
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2):good！ 2010-10-27 19:56:18
PCR产物3‘是羟基，载体5’是磷酸，这个地方是连上的。PCR产物5‘是羟基，载体的3’也是羟基，这个地方应该是没连上的吧，不知道Taq酶能不能过去，我瞎猜的哈
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4楼2010-10-27 12:51:26
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gylry

铜虫 (小有名气)
★
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我也正想问关于连接的问题呢，请高人指点
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5楼2010-10-27 13:24:13
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dqvictory

铁虫 (小有名气)
是啊，请教各位高手啦~T4的连接产物我不做TA克隆，想直接用作模板PCR扩增，问题见上啊
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把记忆随身携带！
6楼2010-10-27 13:34:18
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-27 13:37:47
是可以的，但是其中一条引物要用载体上的序列来设计，通常用载体上的通用引物来做，另一端可以选载体上的序列，也可以选插入片段远端的序列来做。

祝好运
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2010-10-27 13:35:49
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
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amisking(金币+1):鼓励交流！ 2010-10-27 19:57:12
我也想知道楼主为啥要把链接产物做PCR，如果连成线性的估计引物一条设计在载体上一条设计在目的序列上应该可以进行PCR，环状的如果连完了能P吗？好像除了做滚环的P酶别的办法吧。
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8楼2010-10-27 14:04:42
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

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引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-10-27 14:04:42:
我也想知道楼主为啥要把链接产物做PCR，如果连成线性的估计引物一条设计在载体上一条设计在目的序列上应该可以进行PCR，环状的如果连完了能P吗？好像除了做滚环的P酶别的办法吧。

呵呵，环状的当然能P啊。否则反向PCR是咋做的？你又不是要复制整个质粒，而是P其中的一个片段。否则你连接到T载体上去测序，你以为是怎么测得呢？
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9楼2010-10-27 14:12:11
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-10-27 14:12:11:



呵呵，环状的当然能P啊。否则反向PCR是咋做的？你又不是要复制整个质粒，而是P其中的一个片段。否则你连接到T载体上去测序，你以为是怎么测得呢？

反向PCR，连接的是酶切的末端，5‘都有磷酸，当然能连上
而测序的那都是在菌里复制过的了，肯定没有nick
而PCR产物直接连接的情况是不一样的
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10楼2010-10-27 14:33:32
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