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dqvictory

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接产物,是否可以直接做PCR模板?已有10人参与

请教各位大侠:
    T4酶要不要先灭活其中的T4连接酶?Buffer中的离子对PCR反应有影响吗?如果需要的话,要怎样进行纯化呢?
    谢谢啦!
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brightfuture01

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dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-27 13:37:47
是可以的,但是其中一条引物要用载体上的序列来设计,通常用载体上的通用引物来做,另一端可以选载体上的序列,也可以选插入片段远端的序列来做。

祝好运
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2010-10-27 13:35:49
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brightfuture01

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引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-10-27 14:04:42:
我也想知道楼主为啥要把链接产物做PCR,如果连成线性的估计引物一条设计在载体上一条设计在目的序列上应该可以进行PCR,环状的如果连完了能P吗?好像除了做滚环的P酶别的办法吧。

呵呵,环状的当然能P啊。否则反向PCR是咋做的?你又不是要复制整个质粒,而是P其中的一个片段。否则你连接到T载体上去测序,你以为是怎么测得呢?
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9楼2010-10-27 14:12:11
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brightfuture01

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引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-10-27 14:33:32:

反向PCR,连接的是酶切的末端,5‘都有磷酸,当然能连上
而测序的那都是在菌里复制过的了,肯定没有nick
而PCR产物直接连接的情况是不一样的

,要我给你上文献么? 核酸研究杂志上的,1998年的文献。
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13楼2010-10-27 15:42:33
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