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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌落PCR为什么每次都扩不出来呢？
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带刀猎人

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌落PCR为什么每次都扩不出来呢？ 已有9人参与

我做菌落PCR，可是每次都P不出来。是因为革兰氏阳性菌菌壁较厚导致的菌体不能裂解吗？所以体系中模板量不足？
我用1%的TRITON- X100裂解后，先对裂解上清跑了一下电泳，结果是菌体能成功裂解，但是基因组DNA不能在胶里泳动，电泳40分钟后大部分DNA都还是在点样孔里。甚至有部分向阴极泳动。
这样的模板能直接加入PCR体系扩增吗？会不会导致扩增产物也是不能在胶里泳动？
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1楼 2010-10-14 20:02:21
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由，人权之基。

优秀版主
★ ★ ★ ★ ★ ★
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scelab(金币+5):辛苦猴哥了 2010-10-14 22:23:49
革兰氏阳性菌你还用菌液PCR？ 细胞都不知道杀死没

一般大肠杆菌用菌液PCR都很不稳定的

你想P的基因不会在基因组里吧？就算在质粒里也不一定能P出来 何况基因组。

你所描述的电泳根本就不对，如果基因组提出来了 肯定是会移动的 在点样孔里的不是核酸
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从小就学习鲁迅，直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助，却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊！
2楼2010-10-14 21:11:25
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带刀猎人

新虫 (小有名气)
我想是不是因为triton-X100的粘度比较大导致点样孔里的DNA不能泳动，还有就是triton使DNA带了正电荷，因为在紫外灯下可以看到明显的后移条带。我是扩增16srDNA我们实验室以前都是用菌落PCR的，能扩增出来，可我就是扩不出来，郁闷！

老大，再给指教指教吧！
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3楼2010-10-15 10:42:17
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
★
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建议提质粒进行PCR，菌落PCR很不准的。
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4楼2010-10-15 10:55:33
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hulqi

金虫 (正式写手)
★
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电泳反着跑？插错电极没 ？
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5楼2010-10-15 11:05:42
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qwk123

禁虫 (正式写手)
★
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6楼2010-10-15 11:07:46
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xiezhenrong

金虫 (正式写手)

北斗星
★
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你所用的PCR试剂有无问题？新划板革兰氏阴性菌一般PCR是可以P出条带的，不过挑菌体挑多了也会P不出来！
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海阔凭鱼跃，天高任鸟飞！
7楼2010-10-15 12:40:43
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天龙n部

金虫 (小有名气)
★
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我们好像很好P啊，你不会没连上目的基因吧
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8楼2010-10-15 13:55:09
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丰之第

铜虫 (正式写手)

小牛

★
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你可能是把培养基挑在里面了。建议先处理，后pcr。多看看文献。我也做过你上面的实验，刚开始都这样。
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9楼2010-10-15 15:55:37
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biowandy

木虫 (正式写手)
★
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菌落 PCR假阳性很高才对啊 ，  不过一般加热时间够长 不可能不会破碎， 应该是模板量不够，
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10楼2010-10-15 16:10:57
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