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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因组PCR老P不出目的带
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang

[交流] 【求助/交流】基因组PCR老P不出目的带已有27人参与

模板用基因组DNA，引物碱基数25，GC含量为64和56，Tm值为68.54和65.26
目的带约2.2K
我试过退火温度58  60  63  65  66  68
酶试过rTaq   ExTaq   还有高保真酶
buffer也换过几种

大多数时候出现引物二聚体，有时出现估计几十K但很弱的条带（接近上样孔的地方），有时什么都没


很郁闷，很无助


问题在哪里呀？
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每天进步一点点，持之以恒！
1楼2010-08-27 10:26:31
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fykxy_206

木虫 (正式写手)
★
张晓梅ZXM(金币+1):谢谢参与
温度再降低点，引物重新设计，最好有好几对引物一块做。
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4楼2010-08-27 14:05:32
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
★
张晓梅ZXM(金币+1):谢谢参与
张晓梅ZXM(金币+1): 2010-08-27 16:40:14
引用回帖:
Originally posted by 张晓梅ZXM at 2010-08-27 10:26:31:
模板用基因组DNA，引物碱基数25，GC含量为64和56，Tm值为68.54和65.26
目的带约2.2K
我试过退火温度58  60  63  65  66  68
酶试过rTaq   ExTaq   还有高保真酶
buffer也换过几种

大多数时候出现引物二聚体 ...

可能引物设计失败。还有你要保证你的体系能扩出东西来，你的基因组质量是好的。
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2楼2010-08-27 12:00:09
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
张晓梅ZXM(金币+1):谢谢参与
几十k？ 模板加多了吧
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3楼2010-08-27 12:04:07
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lfkey

木虫 (初入文坛)
★ ★
张晓梅ZXM(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1):鼓励交流 2010-08-31 11:51:24
温度太低特异性会减弱，我觉得不能低于60度，引物可以少加点，另外摸索退火温度时间隔可以再小点；重新设计引物到可以考虑一下。检测能否扩增出条带的话，我觉得应该没有酶或者buffer的事。
赞一下(2人) 回复此楼
年轻没有失败！
5楼2010-08-27 16:32:23
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