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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助蛋白纯化问题
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zhshch2009

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助蛋白纯化问题 已有9人参与

请问高手：我的蛋白样品上样之后，会立刻显示出一个峰，之后用咪唑洗脱，咪唑浓度最终洗到500mM，也一直没有洗脱峰出现，UV监测基本都是平缓的。请问是什么原因，我已做过western ,证明我所表达的蛋白已经带了his-tag,但是用镍柱就是纯不出来～很想知道为什么。
谢谢！
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1楼 2010-06-13 10:42:13
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的蛋白表达量高吗？
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2楼2010-06-13 10:53:23
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zhshch2009

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 泡泡9706 at 2010-06-13 10:53:23:
你的蛋白表达量高吗？

我摇了一升的菌液，提的包涵体，变性复性之后上的柱，跑SDSPAGE看目的条带非常浓，那请问表达量要达到什么值才可以挂柱呀？
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3楼2010-06-13 10:55:57
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fluleaf

捐助贵宾 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-13 20:54:42
你的样品溶液没用平衡缓冲液透析，导致上样完就有峰出现；蛋白没挂上去可能需要优化上样条件，或者树脂有问题。
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4楼2010-06-13 11:01:11
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-06-13 20:55:05
引用回帖:
Originally posted by zhshch2009 at 2010-06-13 10:55:57:

我摇了一升的菌液，提的包涵体，变性复性之后上的柱，跑SDSPAGE看目的条带非常浓，那请问表达量要达到什么值才可以挂柱呀？

这倒不是问题，是表达量很少的话由于镍离子渗漏会纯不到蛋白。
你说的变性复性，就是说你的蛋白已经有活性了吗？即使这样，his标签也很可能被折叠到蛋白内部，挂不上柱。
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5楼2010-06-13 11:12:39
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流，继续追加。 2010-06-15 09:00:56
Binding buffer中咪唑用多大浓度？
感觉你的蛋白没有挂柱直接穿透了。既然存在标签，有可能你的标签被包括在蛋白内部了，换到另外一端试一试，两端都加标签。
再不行就换GST标签，还有一定增容的效果呢。
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6楼2010-06-15 08:57:23
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zhshch2009

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fluleaf at 2010-06-13 11:01:11:
你的样品溶液没用平衡缓冲液透析，导致上样完就有峰出现；蛋白没挂上去可能需要优化上样条件，或者树脂有问题。

谢谢！请问平衡缓冲透析液是不是纯化时用的binding buffer？从哪些方面优化上样条件？
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7楼2010-06-23 10:58:44
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zhshch2009

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 泡泡9706 at 2010-06-13 11:12:39:

这倒不是问题，是表达量很少的话由于镍离子渗漏会纯不到蛋白。
你说的变性复性，就是说你的蛋白已经有活性了吗？即使这样，his标签也很可能被折叠到蛋白内部，挂不上柱。

我也不知道是否还有活性，因为没有监测的方法，所以只能先纯，看能不能纯出来~谢谢！
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8楼2010-06-23 11:00:48
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zhshch2009

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-06-15 08:57:23:
Binding buffer中咪唑用多大浓度？
感觉你的蛋白没有挂柱直接穿透了。既然存在标签，有可能你的标签被包括在蛋白内部了，换到另外一端试一试，两端都加标签。
再不行就换GST标签，还有一定增容的效果呢。

50mM的浓度，我想再优化一下表达条件，让它在上清里有表达，包涵体好麻烦~~谢谢！
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9楼2010-06-23 11:02:08
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zhshch2009 at 2010-06-23 11:02:08:

50mM的浓度，我想再优化一下表达条件，让它在上清里有表达，包涵体好麻烦~~谢谢！

50mM？？？？？
太太太太太太高高高高高高高高高高了。

我的蛋白属于结合力极强的那种，我一般使用20mM咪唑，如果结合力很弱用10mM或者5mM甚至不加咪唑上样。
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10楼2010-06-23 12:54:12
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