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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助蛋白纯化问题
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):建议很中肯~~感谢交流~~ 2010-06-24 15:10:23
上请即使有非常少量的表达，也最好别做包涵体。
很有可能His tag在折叠的时候被包入蛋白里面。可以在变性之后直接挂镍柱。纯化之后再复性。（如果你的镍柱够好的话）
如果不行就换其他的纯化方法，比如离子交换。
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
11楼2010-06-23 13:18:29
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
是否有此蛋白的结构报道，可以根据报道预测带标签的一端是否形成高级结构，从而将标签包含进去。
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12楼2010-06-23 15:20:52
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zhshch2009

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by goodwish at 2010-06-23 13:18:29:
上请即使有非常少量的表达，也最好别做包涵体。
很有可能His tag在折叠的时候被包入蛋白里面。可以在变性之后直接挂镍柱。纯化之后再复性。（如果你的镍柱够好的话）
如果不行就换其他的纯化方法，比如离子交换。

我试过复性之后再上柱，结果差不多，查的网上资料说是尿素会将柱子还原，我用的8M尿素又加了巯基乙醇，这样会对柱子有影响吗？
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13楼2010-06-24 09:28:24
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zhshch2009

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zemin_fang at 2010-06-23 15:20:52:
是否有此蛋白的结构报道，可以根据报道预测带标签的一端是否形成高级结构，从而将标签包含进去。

这样啊！还真没从这方面考虑过，谢谢！我去查一下
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14楼2010-06-24 09:29:15
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zhshch2009

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-06-23 12:54:12:



50mM？？？？？
太太太太太太高高高高高高高高高高了。

我的蛋白属于结合力极强的那种，我一般使用20mM咪唑，如果结合力很弱用10mM或者5mM甚至不加咪唑上样。

那我试一下，谢谢！
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15楼2010-06-24 09:30:41
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himoo123

铁虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-06-26 23:17:18
是啊，你用的imidazole初始浓度太高了。和表达量没关系吧。你再加点100mM NaCl 看看。
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16楼2010-06-24 14:46:11
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
★
scelab(金币+1):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-06-26 23:17:23
一挂上去就有峰出现，不就说明没挂上嘛，再洗脱也没有用啊
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17楼2010-06-26 22:15:27
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edoz1986

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
复性失败也不挂柱子的。也有可能你的6个his被折叠到分子内部了。通常是先在变性条件下纯化，然后在复性。
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18楼2013-05-23 09:31:38
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