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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】悬浮细胞 挑单克隆
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honglanbai

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】悬浮细胞 挑单克隆已有3人参与

有谁做过悬浮细胞挑单克隆的。
1.大家都是用什么方法挑的呀，有的说用有限稀释法，有的说先稀释好一个浓度，然后铺一个孔有一个或者0.5个细胞，但是怎么才能确定一定是单克隆啊，有的时候即使你稀释的很低，也会有几个细胞在一起？
2.96孔板一般铺完几天不动，要不要换液，几天换一次，怎么换液？
3.有没有做过CHO-S的挑单克隆的。
4.细胞不爱活怎么办，谁有好办法吗？
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1楼2010-06-10 11:08:57
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
如果带有荧光蛋白标记，那么悬浮细胞很适合用流式来挑单克隆
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2楼2010-06-10 11:28:19
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honglanbai

木虫 (正式写手)
我这个没有荧光
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3楼2010-06-10 15:01:34
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
honglanbai(金币+1): 2010-11-08 10:11:06
普通书上推荐的就是有限稀释法，如果你稀释之后还是有一个孔出现多个克隆的请款个，说明你在前面计数的时候不是很准确，数的太少了。另一个方面是你的细胞并没有完全分散，所以你可以铺几个不同的浓度，以保证一次试验中等到你想要的单克隆。
是否跟换培养基要依据你细胞的生长特性来判断，一般前几天不要动细胞板，避免晃动。
“细胞不爱活”不知道什么意思？我想有几个原因，有可能细胞原来状态不好 ，分散之后细胞生存能力更差了。也有可能前面状态好，但是因为细胞密度太小了，也不是很好存活等原因。你可以考虑提高培养基中营养成分或者加入一定的细胞因子或者加入一定的饲养层等方法试试。
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52187644
4楼2010-06-11 14:01:48
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honglanbai

木虫 (正式写手)
我今天看了下细胞，发现仅个别孔中有活细胞，而这些孔，按稀释浓度推算应该不是单克隆的，还有些孔中有死细胞，应该是先长了几天又死了的，不知道是不是我在第五天换液（吸出100ul，再补加100ul）的时候弄死的，目前我铺的板子已经长了8天了，看来这次要失败了。
“加入一定的细胞因子或者加入一定的饲养层等方法试试”，请问细胞因子、饲养层一般指什么。
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5楼2010-06-11 15:56:41
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
honglanbai(金币+1): 2010-10-18 11:14:46
honglanbai(金币+1): 2010-11-08 10:11:12
我觉得应该不要换液，如果你的细胞平时的生长周期是48h，也就是说你克隆后至少要三到四天都不要动他。先观察下再说，何况你那是悬浮细胞，换个也是不是还有细胞在孔里面呢。
你应该知道淋巴细胞增殖实验的原理，里面就有辅助成分。
另外你可以考虑下是否用固化的方式将你的细胞固定后让其在一定的条件中生长，很方便判断是否但克隆，参考空斑实验。
或者其他文献中提供的方法。
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52187644
6楼2010-06-11 20:27:52
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honglanbai

木虫 (正式写手)
继续等待
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7楼2010-06-19 19:44:24
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hshzhq

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你需要用过滤网过滤一下旧培养液，旧的培养液里面有一些生长信号，但是单克隆挑选的细胞单细胞是不会自己分泌信号给自己的，也可以一半fresh medium，一半old medium。

[ Last edited by hshzhq on 2012-1-2 at 10:34 ]
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8楼2012-01-02 10:31:17
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
鼓励回帖，可好像楼主发帖很久了吧
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9楼2012-01-02 13:55:38
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keennes

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
用流式细胞来选当然是好，而且快，但是容易污染，特别是支原体污染，很难处理的。如果时间足够或者对细胞质量要求高，建议用有限稀释法，挑选阳性细胞多的孔，再稀释，直到镜检全为阳性细胞。虽然耗时，但是最放心。
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独上高楼，望尽天涯路……
10楼2012-03-14 09:48:54
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