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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助酿酒酵母转化
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bulebird

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助酿酒酵母转化 已有3人参与

我在实验过程中遇到的问题是：转化A+KanMX+B这个片段进入酿酒酵母基因组（A,B片段分别是酿酒酵母X基因外部上下游约500bp的同源区），得到X基因缺失的转化子。重组后一方面将KanMX基因引入酵母染色体，使重组菌株产生G418抗性；另一方面，KanMX片段同源重组替换了酵母染色体上的X基因，从而实现该基因的敲除。
用抗性基因的上下游引物扩增转化子能正确扩增KanMX抗性基因大小的片段，但是在X基因外部和KanMX抗性基因内部设计的一对引物扩增，始终没有扩增出来（应该不是PCR的问题）。我怀疑是转化过程遇到了问题，导致的假阳性。
想请教酿酒酵母电转化的方法，及一些注意事项。
如果哪位虫友知道某个研究所或企业能做这方面的实验，向我介绍一下。合作也可以。
谢谢！！！
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1楼 2010-04-16 14:44:54
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
bulebird(金币+1): 2010-05-04 10:53
最近在做相同的实验，不是很顺利，我用的同源臂两端分别为35 bp和36 bp.电转的，你的同源臂也太长了吧。
另外你的G418筛选浓度是多大，听说这个筛选不是很灵敏，可能要将终浓度定在mg/mL级。另外竟然能扩增到kanmX片段，建议切胶回收，测序吧。
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Thank-you，so-blue.
3楼2010-04-26 11:26:30
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-16 22:00
bulebird(金币+2): 2010-05-04 10:53
500bp的同源序列不需要做电转的，你怎样验证的转化子啊？是挑的纯的单菌落吗？我怀疑，你的体系污染造成的假阳性（PCR或者菌落与转化物）

建议重新转化，抗性板做的仔细，菌落挑好重接新的抗性板后再做菌落PCR。

另外，电转的方法也很简单，你不做文库筛选，按照一般英文的Protocol都行。
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2楼2010-04-16 14:57:41
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