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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于连接转化的问题
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邢曙光

木虫 (小有名气)

[求助] 关于连接转化的问题 已有1人参与

酶切800bp的片段连接5800bp的载体，酶切4000bp的片段连接5800bp的载体，连接完了用T7通用引物来p，能够p出来，然后用连接体系去转化，平板什么也不长，我用提好的别的质粒做对照，长满了一平板，求助我这是什么问题，做了三个月的连接转化了，再做不出来就想换课题了，求各位大神帮我分析是哪里出了问题

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1楼 2017-06-16 09:46:44
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jcstone1027

铁杆木虫 (正式写手)

木虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-17 07:45:33
我觉得主要跟浓度有关系，就是PCR产物要确保比较高的浓度，特别是4000这个浓度更要高，因为算起来太大了，这种大的片段建议可以换一下感受态细胞，有些感受态细胞对转化大片段效果会好一些。
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学习，交流
2楼2017-06-16 11:00:25
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邢曙光

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jcstone1027 at 2017-06-16 11:00:25
我觉得主要跟浓度有关系，就是PCR产物要确保比较高的浓度，特别是4000这个浓度更要高，因为算起来太大了，这种大的片段建议可以换一下感受态细胞，有些感受态细胞对转化大片段效果会好一些。

Cas9是23.3纳克每微升，表达载体是18.8纳克每微升，试过载体与片段1:3，1:4，1:5，1:6这样的配比都没有结果，重新换了新感受态还是不行真无奈

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3楼2017-06-16 15:38:51
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jcstone1027

铁杆木虫 (正式写手)

木虫
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-17 07:45:47
就是说你PCR验证的时候就是用通用引物和序列引物验的吗，如果是这样的话，那就可以排除酶切的问题了，实际上我觉得你还是需要提高片段浓度，比例这些没那么严格，我之前出过问题，罕见的是连接酶有问题，连接效率过低，因为PCR很灵敏，扩出来不代表一定能转化出来，所以就是浓度，还有可以考虑下连接酶的问题。

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学习，交流
4楼2017-06-16 16:14:18
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
外包丢给我吧、··~~~
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5楼2017-06-16 22:14:08
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匿名

用户注销 (著名写手)
本帖仅楼主可见
6楼2017-12-27 01:33:49
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